琼脂扩散试验检测羊口疮病毒

鲜思美，吴 健，杨 钰，刘宗胜，刘 嫒，苏 刚

（1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物疫病研究所，贵州 贵阳 550025；3.毕节市七星关区农牧局草地中心，贵州 毕节 551700；4.毕节市动物产品质量安全监督检验所，贵州 毕节 551700）

羊口疮（Orf）亦称羊传染性脓疱皮炎、羊传染性脓疱口炎、羊传染性脓疱，是危害山羊和绵羊的一种高度接触性传染病，其发病率为2.2%～17.7%，病死率为0～51.4%，羊口疮在养羊的国家和地区普遍发生，常呈群发性流行，是严重威胁养羊业，具有重要经济意义的病毒病。同时该病是一种急性、高度接触性人兽共患传染病，对人类健康构成威胁［1］。由于OrfV与其他许多病原(如口蹄疫病毒、羊痘病毒)感染动物后的临床症状非常相似，临床上极其容易造成误诊。目前，诊断Orf的方法有电子显微镜检查、病毒分离、动物接种试验、血清学方法、PCR扩增和LAMP技术等［2］，但相对于基层养殖场（户）有必要寻找一种简便、适用的血清学诊断方法。本试验将羊口疮痂皮毒回归兔体，制备高免血清，进行琼脂扩散（AGP）试验，效果较好。报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验动物 选择体重2 500 g以上，健康无病家兔，饲喂观察7 d后供制备高免血清用。

1.2 受检材料 Orf-HZ病料采自贵州省赫章县；Orf-DF病料采自贵州省大方县；Orf-ZY病料采自贵州省镇远县；Orf-CQ病料采自重庆病料；Orf-CS病料，采自贵州省长顺县。羊口疮细胞毒、健康山羊血清、兔血清和羊正常皮肤组织由本实验室保存。

1.3 对照毒株 山羊痘疫苗，批准文号：新生药字（2001）284403；口蹄疫病毒O型、亚洲I型二价灭活疫苗，批准文号：兽药生字（2007）310017047。

1.4 兔抗羊口疮病毒高免血清的制备［4］

1.4.1 羊口疮痂皮毒抗原的制备 称Orf痂块毒1 g，加含10 000 IU/mL双抗30 mL，充分研磨，超声波乳化破碎3次后，4℃静置过夜。以5 000 r/min离心15 min，取上清液，加含0.9%NaCl的PEG6000沉淀病毒，4℃过夜后，以10 000 r/min离心20 min，弃上清液，沉淀用适量生理盐水溶解，装入透析袋中0.9%NaCl透析24 h，包埋于PEG6000浓缩至10 mL，-20℃保存备用。

1.4.2 兔抗羊口疮病毒高免血清的制备 取羊口疮痂皮毒抗原1 mL，加入弗氏完全佐剂1 mL，混合均匀，制成包被抗原，于家兔的两股内侧和脊椎两侧皮内各注射10个点，第7天重复注射1次；第14天耳静脉注射羊口疮痂皮毒抗原0.5 mL，第21天再耳静脉注射0.5 mL，同时在脊柱两侧皮内分两点注射羊口疮痂皮毒抗原各0.1 mL；第28天心脏采血，分离血清[7]，于灭菌瓶内-20℃保存备用。

1.5 琼脂扩散试验（AGP）

1.5.1 琼脂板的制备 采用PEG平板，在普通平板的基础上加聚乙二醇，操作术式按7孔型打孔。

1.5.2 琼脂扩散试验 在琼脂板的中央孔加兔抗OrfV高免血清（已采用正常羊皮肤抗原吸收处理），周边孔加被检抗原，加样完毕后，将平板放入湿盒内，放入37℃恒温箱，20 h左右开始观察，在阳性血清孔与被检抗原孔之间出现明显沉淀反应者即判为阳性。

1.5.3 兔抗羊口疮高免血清最佳作用浓度的方阵分析［5］将所制得的兔抗OrfV高免血清加入中央孔，琼脂扩散阳性抗原加入周边孔，抗体、抗原分别作原液，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256倍比稀释，抗体的每一个稀释度分别与抗原的各稀释度进行琼扩试验方阵分析，从而确定琼脂扩散抗体的最佳浓度。

1.6 特异性试验及其阻断试验

1.6.1 特异性试验 取最适稀释度的琼脂扩散诊断抗体与山羊痘疫苗毒、口蹄疫疫苗毒作交叉试验。

1.6.2 特异性阻断试验［6］为了进一步验证琼脂免疫扩散试验检测Orf病毒的特异性，笔者用兔抗Orf血清50 μL分别与50、100、150、200 Orf病毒和250 Orf病毒混合，37℃作用1 h。再与50 μL Orf病毒抗原进行琼扩试验观察结果。

1.7 临床疑似羊口疮病料的抗原检测 5份临床疑似羊口疮病羊的痂皮分别制成1∶1～1∶2的乳剂，经3次反复冻融后，离心，取上清液，作为待检抗原分别与琼脂扩散诊断抗体进行试验。

2 结果

2.1 羊口疮痂皮毒抗原与兔抗羊口疮高免血清的AGP方阵分析 结果见（表1）。

表1 羊口疮痂皮毒抗原AGP方阵分析结果

由表1可以看出，羊口疮痂皮毒抗原从兔体制备的高免血清经琼扩试验检测血清价为1∶16。与最高稀释度抗原形成沉淀线的抗体的最高稀释度为1∶4，实际检测时以1∶4倍稀释作为诊断抗体。

2.2 特异性试验结果 取最适稀释度诊断抗体与山羊痘疫苗毒、口蹄疫疫苗毒进行AGP，结果这2种阳性抗原与诊断抗体之间没有出现沉淀线（图1）；特异性阻断试验兔抗Orf血清50 μL与100、150、200 Orf病毒和250 Orf病毒抗原混合作用后，再与50 μL Orf病毒抗原进行琼扩试验，未见沉淀线（图2）。

由图1可知，1∶4倍稀释的羊口疮诊断抗体与羊口疮痂皮毒和细胞毒之间出现明显的白色沉淀线，而与羊口疮阴性血清、生理盐水、山羊痘疫苗毒和口蹄疫疫苗毒之间未见沉淀线；由图2可知，50 μL羊口疮阳性血清能被100、150、200痂皮毒和250的痂皮毒特异性阻断，表明应用兔抗羊口疮高免血清来检测羊口疮病毒抗原的反应是特异的。

2.3 临床疑似羊口疮病料的抗原检测结果 对5例不同地区临床疑似羊口疮痂皮毒抗原的检查结果：CS病料、ZY病料和DF病料均是在2 h出现明显的沉淀线，CQ病料、HZ病料在20 h后出现沉淀线（图3）。

3 小结和讨论

3.1 本试验中用痂皮毒抗原从兔体制备的高免血清效价为1∶16；抗体1∶16倍稀释，可检测到1∶4倍稀释的痂皮毒抗原，而抗体作1∶4倍稀释，则可检测到1∶128倍稀释的痂皮毒抗原，为了避免漏检，我们认为高免血清1:4倍稀释是诊断用抗体的最佳浓度。

3.2 羊口疮痂皮毒抗原制备兔抗Orf高免血清琼扩效价与王廷璞等［4］报道一致，均为1∶16，这与Orf V具有高度的嗜上皮性，主要引起局部强烈的免疫反应，且以细胞免疫为主，体液免疫水平较低有关。通过方阵分析后，诊断抗体浓度为1∶4应用于5份临床疑似病料的检测取得了很好的效果，而健康山羊血清和兔血清不和待检抗原产生沉淀线。

3.3 痂皮毒抗原免疫家兔制备的高免血清在未经处理的情况下，能与相应的痂皮毒抗原产生沉淀线，同时也可以和羊正常皮肤抗原产生沉淀线；采用羊正常皮肤抗原吸收处理后的兔抗羊口疮高免血清再进行琼扩反应，与痂皮毒抗原产生沉淀线，而与正常皮肤抗原不产生沉淀线，说明该诊断抗体经羊正常皮肤抗原吸收处理后可以用来诊断本病。

3.4 山羊痘病毒、口蹄疫病毒和羊口疮病毒感染羊在临床症状和病理变化相似，难以及时鉴别诊断。山羊痘抗血清能中和羊口疮病毒，但羊口疮血清不能中和山羊痘病毒，羊口疮高免血清作为诊断抗体通过特异性试验及其特异性阻断试验，结果表明，应用兔抗羊口疮高免血清来检测羊口疮病毒抗原的反应是特异的，不与GPV、FMDV抗原发生交叉反应，这一诊断方法可将GPV与OrfV引起羊的皮肤症状为主的疫病区别开来。所以，建立该方法具有重要的应用价值。

[1]张家确，吴景央.一起人畜共患羊传染性脓疱病的调查[J].中国兽医杂志，2006，42（9）：53-54.

[2]刘永杰，张克山，孔汉金，等.羊传染性脓疱诊断技术研究进展[J].动物医学进展，2013，34（2）：96-99.

[3]王廷璞，薛双虎，吕武夫，等.酶联免疫吸附试验检测羊传染性脓疱病毒[J].甘肃畜牧兽医，1995，1：3-4.

[4]鲜思美.应用琼脂扩散试验检测新城疫抗原[J].贵州畜牧兽医，2002，26（2）：5-6.

[5]程安春.琼脂扩散试验检测雏鹅新型病毒性肠炎病毒及抗体的研究[J].中国兽医杂志，1999，25（3）：3-6.