贵州省某规模化猪场暴发猪伪狂犬病与大肠杆菌混合感染的诊断

李 达，汤德元，李春燕，罗险峰，曾智勇，刘 建，郝 飞，王洪光

（1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008）

2014年3月，贵州省开阳县某规模化猪场送检断奶仔猪10头，其中4头死亡，6头病危，1 d后其余病危的6头相继死亡。为了了解该猪场疫病的感染状况，对该规模化猪场送检的发病仔猪进行流行病学调查、临床症状观察、病理剖检、细菌学和PCR技术诊断，确诊为猪伪狂犬病和猪大肠杆菌混合感染。报告如下。

1 流行病学调查

该猪场断奶仔猪未免疫猪伪狂犬病疫苗，发病突然，1～3 d共计有80头断奶仔猪发病，死亡36头，病猪发热，体温升高到40.0℃～41.0℃，精神沉郁，食欲不振，喘气，被毛粗乱，血液稀薄。发病后猪场曾使用青霉素、链霉素等抗生素进行治疗，病猪体温有所降低，但发病后2～3 d死亡。

2 临床症状及剖检病理变化

病猪主要症状是脱水和下痢，黄痢仔猪排黄色稀便，急性病例不见症状而昏迷死亡。白痢仔猪排出乳白色浆液状、糊状粪便。随着病情的发展，出现食欲废绝，有的眼屎多、眼睑红肿，眼圈发紫、结膜潮红，有的病猪尖叫、磨牙，有的病猪耳朵发青、发紫、身体发绀，有的病猪出现呼吸困难，最后窒息死亡。

剖检病理可见喉头、扁桃体充血、皮下组织水肿；肠系膜淋巴结和下领淋巴结充血、肿大，间有出血；肺部有局灶性炎症，并伴有充血、出血、淤血条纹和水肿，切开有泡沫；肝脏边缘呈紫黑色、表面有许多散在的、颗粒状大小不一的白色坏死斑点；肾脏表面有针尖大小出血点，肾脏切面有散在坏死点。

3 实验室诊断

3.1 猪伪狂犬病ELISA初步检测血样 应用猪伪狂犬病ELISA试剂盒对抽取的10份血清进行检测，检测结果表明，由于该规模化猪场未接种伪狂犬病疫苗，根据送检的10头仔猪血样采集进行的ELISA检测阳性率达80%，从而初步诊断该规模化猪场存在PRV感染。

3.2 细菌分离培养及形态观察 无菌采集取病死猪的肝、肺、肾、脾脏、肠系膜淋巴结病料同时进行接种普通琼脂平板、血液琼脂平板、麦康凯琼脂平板培养基上，置于含有5%CO2的37℃恒温培养24～48 h后。淋巴结接种在普通营养琼脂上形成直径约2 mm的圆形、光滑、隆起、湿润、半透明淡灰色的菌落；在麦康凯培养基上生长成较大的呈光滑、湿润、圆形、隆起的粉红色菌落，部分菌株在血液琼脂平板上呈β溶血环。用接种棒挑取可疑菌落制成涂片进行革兰染色，通过涂片镜检为两端钝圆的短小杆菌，偶有2～3个菌体相连，为革兰阴性杆菌，符合大肠杆菌形态特性。

3.3 生化特性鉴定 将细菌纯培养物接种于微量生化鉴定管中，置于含有5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24～48 h后，生化试验鉴定结果表明，该分离株对硫化氢、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、枸橼酸盐、尿素、半固体、赖氨酸、鸟氨酸、氨基酸对照、棉子糖、侧金盏花醇、木胶糖12种发酵管反应呈阳性，对葡磷胨水、山梨醇2种发酵管反应呈阴性。其他生化试验中，吲哚试验阳性，V-P试验阴性，枸橼酸酸盐利用试验呈阴性，七叶苷水解试验呈阳性，均符合大肠杆菌生化特性。

3.4 药敏试验 药敏试验采用世界卫生组织推荐的标准纸片琼脂扩散法（disc agar diffusion），即（K-B法）操作。用接种环挑取1～2环纯培养的分离菌，接种于含5%脱纤绵羊血的M-H琼脂培养基上涂匀，选取12种常用药敏纸片均匀地贴到培养基上，置于含有5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24～48 h后观察结果，测定抑菌圈直径。药敏试验结果表明，从该猪场分离的病原菌对头孢唑啉、阿莫西林、庆大霉素和利福平高敏；对链霉素和妥布霉素中敏；而对氧氟沙星、诺氟沙星和四环素已经产生了耐药性。

3.5 动物致病性试验 取血液琼脂平板上培养的24 h菌落制成细菌悬液(CFU为5×108个∕mL)，分别取0.5 mL采取腹腔注射接种在生长条件相同的10只小鼠，对照组10只注射等量生理盐水。结果接种了分离菌的小鼠均在24～48 h内死亡，对照组没有死亡。无菌取死亡小鼠的心脏、肝脏、淋巴结和脾脏等组织接种在鲜血琼脂培养基上，结果经分离提纯后鉴定，与以上特性相一致,确诊为有大肠杆菌参与的混合感染。

3.6 PCR检测 根据GenBank中PRV GDSH株（E F552427）和Guizhou-DY株（JX417716）的糖蛋白gE基因主要抗原表位序列，设计1对特异性引物（P1、P2），预计扩增片段大小为652 bp，扩增引物序列为（下划线表示限制性内切酶酶切位点）：P1：5′-CGGGATCCGCCGACGACGATGACCTCAAC-3′，P2：5′-CGGAATTCCAGCGTGGCGGTAAAGTTCTC-3′。PCR反应采用25 μL体系：其中ddH2O 5 μL，2×GC BufferⅠ12.5 μL，dNTP 4.0 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，Taq酶0.5 μL。扩增程序为：95 ℃4 min；95℃1.5 min，58℃0.5 min，72℃1.5 min，35个循环；72 ℃10 min。对疑似PRV感染的病料进行提取病毒总DNA（按照DNA试剂盒上说明书进行提取），经PCR扩增后通过1%琼脂糖凝胶电泳得到1条652 bp的片段，阴性对照未见条带（见图1）。测序后与预期结果相符，这说明送检的病料确诊为有PRV的混合感染。

4 讨论

通过流行病学调查、临床症状观察、病理剖检诊断及猪伪狂犬病ELISA检测，初步诊断该规模化猪场断奶仔猪疑似猪伪狂犬病病毒和大肠杆菌混合感染。通过进行细菌分离培养、生化特性、培养特性及动物致病性试验鉴定确诊该细菌为大肠杆菌。PCR结果显示，送检病猪中检出了PRV核酸阳性条带，测序后与预期结果相符，均为PRV，并且该规模化猪场断奶仔猪并没有接种猪伪狂犬病病毒疫苗，表明该猪场已经存在PRV感染。综合分析以上结果，建议该规模化猪场紧急接种猪伪狂犬病病毒疫苗，加强饲养管理并合理投喂抗生素避免继发感染，同时将可疑猪和病猪全部隔离饲养，病死猪及污染物则彻底焚烧或深埋，对污染的圈舍和四周环境进行严格消毒，患病猪群则隔离治疗并带猪消毒，对新购进猪要进行严格的隔离、检疫，隔离期间定期进行血清学抗体检测。药敏试验表明，该猪场在治疗时可将头孢唑啉、阿莫西林、庆大霉素和利福平作为治疗仔猪大肠杆菌病的首选药物。对于混合或多重继发感染的情况，应当根据实验室检验和药敏试验结果，对症下药，避免乱用药而造成的仔猪的死亡。猪伪狂犬病病毒与大肠杆菌混合感染多表现为急性、发病快、病程短、死亡率高，一旦发病，将带来很大的经济损失，加上现在血清型众多、现有疫苗效果较差、抗菌药物的大量使用，大肠杆菌在选择压力下广泛的产生耐药性。因此，规模化猪场只有建立健全兽医卫生防疫制度，搞好日常卫生管理工作，严格引种，坚持自繁自养，“全进全出”，合理使用预防药物等综合防制措施，才能最大限度的减少疫病的发生。