苦芩总多糖对免疫低下小鼠免疫功能的影响

闫志强 ，朱兆荣 ，刘 娟 ，刘俊玮

（西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 荣 昌 402460）

抵抗感染是免疫的重要功能之一，当动物的免疫功能正常时，就可以通过特异或非特异免疫来消灭侵入机体呼吸道，消化道等的病原微生物，而免疫低下时就会引起机体感染病原微生物从而发病。

苦芩是根据中兽医理论和临床辩证论治的原则，选用由苦参、黄芩、黄芪、金银花、白头翁、栀子组成的中药复方。前期研究表明，苦芩对动物机体免疫功能有一定的增强作用[1-4]，但其可能的作用机理尚不清楚，本试验通过分离提取苦芩中主要活性成分总多糖，并作用于免疫低下小鼠，通过测定与免疫功能相关的指标，以进一步探索苦芩总多糖对小鼠免疫功能的影响，为临床使用苦芩治疗免疫方面疾病提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 昆明系小鼠，体重20±2 g，健康无病，雌雄各半，购自西南大学荣昌校区实验动物中心；苦参、黄芩、黄芪、金银花、白头翁、栀子，购自桐君阁中药批发市场；豚鼠血清补体，购自广州蕊特生物科技有限公司，批号∶111022；环磷酰胺，购自山西普德药业有限公司，批号∶20120304；黄芪多糖注射液，购自四川广汉市本草植化有限公司，批号∶20120318；RPMI-1640培养基，购自Gibco公司，批号∶8111185；苦芩和苦芩总多糖均由西南大学荣昌校区中药创新实验室提供，其药物浓度均为1 mL中含生药40 mg；MTT，购自上海生工生物工程技术服务有限公司，批号∶LJ0901B8011Z；脂多糖，购自Sigma公司，批号∶2070B67；刀豆蛋白A，购自北京邦定泰克生物技术公司，批号∶20100413；其他试剂均为分析纯。

1.2 试验分组处理及模型的建立 将小鼠随机分为空白组、模型组、阳性药物组、苦芩组（20 mg/kg体重）、总多糖高剂量组（40 mg/kg体重）、总多糖中剂量组（20 mg/kg体重）、总多糖低剂量组（10 mg/kg体重），每组小鼠10只。按体重灌胃给药14 d，1次/d。在首次给药后，除空白组外，其余各组腹腔注射环磷酰胺0.2 mL（80 mg/kg体重），建立免疫低下模型，1次/d，连续5 d。空白组与模型组给予等量生理盐水，阳性药物组灌胃黄芪多糖（30 mg/kg体重）。

1.3 碳粒廓清指数测定[5]各组小鼠末次给药1 h后，以0.1 mL/10 g体重的剂量，尾静脉注射处理后的印度墨汁，注射后2、10 min从小鼠眼眶后静脉取血20 μL，立即加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，取正常小鼠血液0.1%的Na2CO3溶液较零，于650 nm测光密度值（OD1和OD2），计算碳粒廓清指数（K）和吞噬指数（α）。

K=（lgOD1-lgOD2）/（t2-t1）；α=K1/3×体质量/（肝质量+脾质量）。其中，OD1、OD2分别代表先后2次所采血样测得的光密度值，t2-t1代表2次采血的时间间隔。

1.4 免疫器官指数的测定 将小鼠处死后，称小鼠体质量，取脾脏和胸腺，称其鲜重，按公式计算脾脏指数和胸腺指数。脾脏指数=脾脏质量/体质量；胸腺指数=胸腺质量/体质量。

1.5 血清溶血素的测定（凝集法）[6-7]给药第7天各组小鼠腹腔注射5%CRBC悬液0.2 mL，免疫7 d，在末次给药24 h后，取血，室温放置1 h，2 000 r/min离心10 min。离心后血清用生理盐水稀释100倍。取稀释后血清1 mL与5%CRBC悬液0.5 mL、10%补体0.5 mL，混匀，在37℃恒温箱中30 min后于0℃冰箱终止反应。2 000 r/min离心10 min后取上清液于紫外分光光度计540 nm处测光密度值OD，溶血素值以半数溶血值HC50表示。HC50=（样品光密度值/CRBC半数溶血时光密度值）*稀释倍数。

1.6 T、B淋巴细胞转化试验测定（MTT法）[7-8]在无菌条件下取脾，研磨成浆液，用含10%新生牛血清及2%庆大霉素的RPMI-1640全培养液重悬细胞，调整脾细胞浓度为3×106个/mL，取96孔细胞培养板，每孔加制备成脾细胞悬液200 μL，刀豆蛋白A 15 μL（终浓度为6 mg/L），8复孔，于37℃5%CO2培养箱中培养72 h。结束前4 h弃上清，加人MTT液20 μL继续培养4 h，吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL终止反应，将96孔板移入平板震荡器，混匀，使MTT还原产物完全溶解，在630 nm波长处测定每孔光密度值（OD值）；以同样的方法，把刀豆蛋白换成脂多糖，测定B淋巴细胞转化情况。

1.7 数据统计分析方法 用SPSS统计软件，对所有数据进行显著性检验，并进行分析比较，数据以平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 苦芩总多糖对小鼠吞噬指数α的影响 试验结果显示，模型组小鼠吞噬指数α下降，与空白组相比，差异极显著（P＜0.01）；苦芩组、总多糖高、中剂量组小鼠吞噬指数α升高，与模型组相比，差异极显著（P＜0.01），总多糖低剂量组小鼠碳粒吞噬指数α升高，差异显著（P＜0.05），各组间存在一定的量效关系，详见表1。

表1 苦芩总多糖对免疫低下小鼠吞噬指数α影响 （X±S）

2.2 苦芩总多糖对免疫低下免疫器官指数的影响 试验结果显示，模型组小鼠免疫器官指数降低，与空白组相比，差异极显著（P＜0.01）；苦芩组小鼠胸腺指数升高，与模型组相比，差异极显著（P＜0.01），脾脏指数升高，差异显著（P＜0.05）；总多糖组小鼠胸腺指数均升高，其中高、中剂量组小鼠胸腺指数与模型组相比，差异极显著（P＜0.01），低剂量组差异显著（P＜0.05）；总多糖组小鼠脾脏指数升高，其中高剂量组小鼠胸腺指数，与模型组相比，差异极显著（P＜0.01），中剂量组有显著性差异（P＜0.05），低剂量组差异不显著，各组间存在一定的量效关系，见表2。

2.3 苦芩总多糖对免疫低下小鼠血清溶血素的影响 试验结果表明，模型组小鼠血清HC50降低，与空白组相比，有极显著差异（P＜0.01），苦芩组、总多糖高剂量组小鼠血清HC50升高，与模型组相比，差异极显著（P＜0.01）；中剂量组小鼠血清HC50升高，与模型组相比，差异显著（P＜0.05），低剂量组差异不显著，各组间存在一定的量效关系，见表3。

表2 苦芩总多糖对免疫低下小鼠免疫器官指数影响 （X±S）

表3 苦芩总多糖对免疫低下小鼠血清溶血素影响 （X±S）

2.4 苦芩总多糖对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响 试验结果显示，模型组小鼠T、B淋巴细胞转化率降低，与空白对照组比，差异显著（P＜0.05）；苦芩组能明显增加T、B淋巴细胞的转化率，特别是对B淋巴细胞的转化率，与模型组比，差异极显著（P＜0.01）；与模型组相比，总多糖组能明显增加T、B淋巴细胞的转化率，详见表4。

表4 苦芩总多糖对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响 （X±S）

3 分析与讨论

巨噬细胞的吞噬、杀伤、抗原加工和呈递、合成和分泌各种活性因子的功能使得巨噬细胞在免疫方面有着相当重要的作用。另外巨噬细胞还是机体非特异性免疫的标志物之一。碳粒廓清指数可以很好的反映机体巨噬细胞的吞噬功能。本试验中苦芩总多糖对免疫抑制小鼠碳粒廓清水平有增强作用，且随剂量增加，增强作用越明显。表明苦芩及其总多糖均对小鼠的吞噬细胞功能有促进作用。

胸腺指数和脾脏指数是评价机体免疫功能状况的重要指标之一，通过免疫器官指数可以间接了解体内淋巴细胞总体水平[9-10]。淋巴细胞转化率是评价细胞免疫功能的一个重要指标[11]。因此免疫器官指数和T、B淋巴细胞转化率都可以直接或者间接来反映机体的体液免疫和细胞免疫状态。本试验中苦芩及其总多糖可以提高小鼠脾脏、胸腺指数，并且T、B淋巴细胞的转化率明显升高。

血清溶血素的测定可以反映机体的体液免疫状态，用药后溶血素生成增多，表明机体体液免疫功能增强[12]。本试验中，苦芩及其总多糖均能增强小鼠血清溶血水平，但其中总多糖低剂量对免疫抑制小鼠溶血水平影响无明显差异，提示苦芩及其总多糖在一定的剂量水平上可增强小鼠血清溶血素。

综上所述，苦芩及其总多糖可以提高吞噬细胞吞噬功能，增强体液免疫和细胞免疫，通过调节机体的免疫系统从而增强机体的免疫功能。

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