BVDV1型和2型焦磷酸测序检测方法的建立

刘海生，张永强，赵永刚，吴延功，王清华，任炜杰，吕 艳，刘春菊，王志亮，单 虎

（1.青岛农业大学山东省兽药诊断试剂工程技术研究中心山东省高校预防兽医学重点试验室，山东 青岛 266109；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266032）

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）属于黄病毒科，瘟病毒属，同属成员还包括猪瘟病毒（CSFV）和羊边界病毒（BDV）。根据病毒5'-UTR基因序列可将BVDV分为BVDV 1型和BVDV 2型。

牛病毒性腹泻/黏膜病是BVDV引起的以牛发热、黏膜糜烂溃疡、白细胞减少、腹泻、咳嗽及怀孕母牛流产或产出畸形胎儿为主要特征的传染病。BVDV已被国内外广泛地研究报道，致病型BVDV 1常在免疫过疫苗的牛群中引起一过性发热和下痢，BVDV 2型的强毒株常引起牛急性感染，表现为发烧、腹泻、血小板减少症、出血、呼吸失调、高流产率和高死亡率，另外，它还能引起怀孕后期母牛的流产、死胎和新生小牛的先天畸形、免疫抑制等[1-3]。持续感染牛（PI）是BVDV在牛群中持续存在和突然暴发的主要原因。PI牛除了引起奶牛腹泻、流产外，与正常牛相比，还会出现体重增重减少、繁殖率大大降低、死亡率高、奶牛屡配不孕等情况。BVD的存在会给牧场造成极大的经济损失[4]，严重影响着畜牧业的发展。

BVDV的诊断方法主要有病毒的分离鉴定，ELISA和real-time RT-PCR等方法。病毒分离鉴定是BVDV的经典诊断方法，但存在操作繁琐，诊断时间较长（1周或更长时间）等不足。ELISA抗原检测方法具有特异性强、重复性好等特点，同时具有敏感性差等缺点，不能检测出牛的BVDV一过性感染。real-time RT-PCR是BVDV常用的病原检测和分型方法，国外已经建立了双重荧光real time RT-PCR检测方法[5]，但是存在易污染，出现假阳性等问题。本研究建立的BVDV 1型和2型焦磷酸测序检测方法能直接读取检测样品的基因序列，实现快速确诊BVDV，对于BVDV的分型、流行病学调查以及净化具有重要意义。

1 材料

1.1 病毒和样品 BVDV-BA株，购自中国兽医药品监察所；牛冠状病毒（BCV）、牛轮状病毒(BRV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒腹泻病毒2型（BVDV2）和猪瘟病毒（CSFV）由中国动物卫生与流行病学中心保存，肠出血性大肠杆菌(EHEC)由青岛农业大学保存，天津某规模化奶牛场86份抗凝血样品。

1.2 主要试剂和仪器 Transcriptor One-Step RTPCR Kit，High Pure Viral RNA Kit，购自 Roche 公司；IDEXX BVDV Ag Serum Plus病原检测试剂盒，购自IDEXX公司；Pyro Gold SQA Reagents 1×96 Pyromark ID，购自Biotage AB公司；PyroMark Q96 MD仪器，购自QIAGEN公司。

2 方法

2.1 引物设计 根据GenBank中BVDV 1、BVDV 2和BDV的5′-UTR基因序列，运用PSQ Assay Design软件分析，设计一对通用扩增引物和分别针对BVDV1和2型的两条测序引物，其中通用引物的下游引物在5端采用生物素标记。引物均从上海生工生物工程技术服务有限公司合成。本研究中所用的引物及其序列详见表1、表2。

表1 扩增引物的序列

表2 测序引物及序列

2.2 RNA提取 采用Roche公司生产的High Pure Viral RNA Kit提取BVDV-BA、BVDV-2、BCV、BRV、IBRV和CSFV的RNA。使用煮沸裂解法提取肠出血性大肠杆菌(EHEC)和肠炎沙门菌的DNA。提取的核酸立即用于RT-PCR扩增或置-80℃保存。

2.3 RT-PCR扩增条件优化和待测样品制备 以提取的病毒RNA为模板，不同退火温度梯度进行RT-PCR反应，取5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

以最优反应条件，分别以BVDV 1型和2型核酸为模板进行RT-PCR，扩增产物分为2份，1份用于焦磷酸测序，另1份送交测序公司测序。

2.4 焦磷酸测序反应

2.4.1 测序单链模板的制备 根据Gene Company Limited公司的焦磷酸测序反应操作说明书制备测序单链模板。将45 μL RT-PCR单链模板分别加入到PSQ 96板的两个孔中，其中一个孔含有45 μL 1型测序引物，另一个孔含有45 μL 2型测序引物，并在85℃的烘箱中放置2 min，取出冷却后就可进行焦磷酸测序。

2.4.2 测序反应 根据PSQTM 96MA System仪器的软件说明书在试剂舱中分别加入的底物APS、dNTP和酶混合物(DNA聚合酶、荧光素酶、ATP硫酸化酶和三磷酸腺苷双磷酸酶)；然后将试剂舱和PSQ 96板放入PSQ TM 96 MD Sys tem仪器中，进行Pyrosequencing反应。

2.5 特异性试验 以BVDV-BA、BVDV-2、BCV、BRV、IBRV、CSFV、EHEC和Salmonella enteritidis的核酸为模板，用优化好的RT-PCR反应条件进行扩增，取5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

用1型和2型测序引物分别对上述RT-PCR产物进行焦磷酸测序反应。

2.6 重复性试验 将扩增的RT-PCR产物分别进行3次焦磷酸测序，比较每次测得的序列结果，确定试验的重复性和稳定性。

2.7 焦磷酸测序检测方法在临床样品上的应用

从牛场采集86份抗凝血，使用Roche公司生产的High Pure Viral RNA Kit提取RNA，进行RT-PCR扩增，取5 μL进行凝胶电泳鉴定，阳性样品进行焦磷酸测序。同时使用BVDV Ag Serum Plus检测86份样品，将阳性样品提取核酸，使用文献[6]中引物进行RTPCR扩增，将扩增结果送交公司测序。

3 结果

3.1 RT-PCR扩增条件优化结果 优化后的RTPCR反应条件为：50℃反转录30 min；94℃预变性7 min；94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 15 s，45个循环；68℃ 7 min。

3.2 RT-PCR反应 采用扩增引物对BVDV 1和2型2株病毒进行RT-PCR扩增，结果均能扩增出与目的条带大小相符的特异性条带（图1）。

3.3 焦磷酸测序反应 BVDV 1和2型的焦磷酸测序反应每次均能测序到30个碱基以上，完全能用于BVDV的快速鉴定和分型。焦磷酸测序结果与普通测序结果完全一致，符合率为100%，序列测定结果图略；证明该试验具有很好的特异性（图2）。

3.4 特异性鉴定结果 以BCV、BRV、IBRV、CSFV、EHEC和沙门菌的核酸为模板的RT-PCR电泳结果没有条带，以BVDV 1型和2型为模板的RTPCR电泳结果显示有惟一目的条带，大小符合预期（图3）。

在焦磷酸测序仪中1型测序引物只与1型的RT-PCR产物结合，2型测序引物只与2型的RTPCR产物结合。本试验具有良好的特意性。

3.5 重复性试验结果 对每个RT-PCR产物进行3次重复性检测，检测的结果均一致，证明该方法有很好的重复性与稳定性。

3.6 焦磷酸测序检测方法在临床样品上的应用结果 对86份样品进行焦磷酸测序，结果显示，有2份BVDV 1型阳性（图4），没有BVDV 2型。与IDEXX BVDV Ag Serum Plus检测的阳性样品测序结果一致。说明该奶牛场感染了BVDV 1型。

4 讨论

BVDV能引起牛腹泻、血小板减少、繁殖障碍、免疫耐受等症状，甚至可以引发黏膜病，给世界养牛业带来了巨大的经济损失。PI牛是牛场中的主要危害，PI牛能长期带毒、排毒，部分PI牛无典型临床症状，严重影响了牛群中PI牛的清除工作。

陈备娟等（2010）对我国11个省市的规模奶牛场进行BVDV感染情况的调查，抽样检测了57个规模奶牛场的大缸奶样，抗体阳性的场有48个，阳性率为84.2%，表明了BVDV在奶牛场具有非常高的感染率[7]。我国需要建立一种准确、快速、高通量的检测方法，用于牛群中BVDV的检测和净化。

焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是近年发展起来的一种能够通过对基因序列测序实现检测和确诊的新型检测技术，具有高通量、快速、敏感等特点[8]，与普通RT-PCR和real time RT-PCR等检测技术相比，本技术无需将PCR产物送交公司测序以便确诊，从而大大减少了病原确诊时间。目前该技术在人乳头瘤病毒和单纯疱疹病毒快速分型上已得到成功应用。

本研究比对了GenBank中绝大多数BVDV 5′UTR序列，设计的扩增引物为BVDV通用引物，能同时扩增出BVDV 1和2型的目的基因片段。针对BVDV1和2型分别设计的测序引物有12个碱基不同，不能与另外1个型发生非特异性结合，但与本型毒株则能很好的结合，具有良好的特异性。由于此方法得到的数据为基因序列图谱，排除了结果为CSFV或BDV的假阳性。本试验发现，在测序反应中，将测序引物浓度从0.3 mol/L调至0.6 mol/L时，能得到峰值更高的图形与结果。

焦磷酸测序方法对PCR扩增产物的浓度与纯度有一定的要求，因此该方法的敏感性低于国外常用的荧光定量分型方法。一过性感染BVDV牛的早期和末期，由于血液中病毒含量少，该方法存在漏检的可能性。但是PI牛长期大量的排毒，病毒含量高，该方法完全可以用于牛场持续性感染牛（PI）的净化。

此外，使用IDEXX BVDV Ag Serum Plus对某奶牛场的86份抗凝血进行了检测，将阳性结果的抗凝血提取核酸，RT-PCR扩增，并送到公司测序。得到的测序结果与焦磷酸测序结果一致，对序列进行进化树分析显示，2份阳性病料均为BVDV 1型。

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