鸡白痢沙门菌对四环素类药物耐药性和耐药基因调查分析

宁家宝，梁梓森，陈建红，张济培，涂玉蓉，司兴奎，牛 森

（1.华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642；2.佛山科学技术学院动物医学系，广东 佛山，528231）

鸡白痢（PD）是由鸡白痢沙门菌引起鸡的一种以雏鸡白痢，母鸡卵巢炎为特征的典型经卵垂直传播传染病。该病不但给养鸡业带来严重的危害，造成巨大的经济损失，同时鸡白痢沙门菌可在家禽肠道内定植，在加工禽胴体时会污染肉质，继而进入人类的食物链。四环素作为兽医临床上最为常用的抗菌药物之一，广泛的应用甚至滥用直接导致了鸡白痢沙门菌对四环素类药物产生耐药性。鸡白痢沙门菌对四环素产生耐药跟其携带的四环素耐药基因有关，目前国内各地区对鸡白痢沙门菌对四环素耐药性及耐药基因携带情况的研究资料相对较少，为了更好地预防和治疗鸡白痢沙门菌病和保障公共卫生安全，很有必要加强相关研究。本课题检测分析了珠三角地区69株鸡白痢沙门菌对四环素的耐药性和四环素耐药基因携带情况，目的为阐明鸡白痢沙门菌对四环素的耐药机制提供更为丰富的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 69株鸡白痢沙门菌，于2005年7月至2011年7月自珠三角地区鸡群分离，利用本实验室建立的鸡白痢沙门菌PCR方法[1]进行鉴定并保存。药敏质控菌大肠埃希菌ATCC25922，购自美国典型菌种保藏中心。

1.1.2 药品与试剂 四环素为AMRESCO公司产品；pMD18-T Vector、premix Ex Taq酶等均为宝生物工程（大连）有限公司产品；琼脂粉和SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；LB肉汤粉和木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂粉均为广东环凯微生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 菌株的复苏 取-40℃保存的菌种划线接种于XLD固体培养基上，于37℃培养16 h；挑取单个典型菌落接种于LB液体培养基中，置于37℃摇床过夜培养。

1.2.2 耐药性的检测 根据CLSI制定的试验方法和判断标准进行试验操作，以大肠埃希菌ATCC25922作为药敏质控菌株，测定69株鸡白痢沙门菌对四环素的耐药情况。

1.2.3 耐药基因的检测 根据文献[2]，分别设计合成tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（M）和tet（X）引物，引物序列及扩增片段长度参见表1。参照《分子克隆实验指南》，采用煮沸法提取细菌DNA模板作PCR反应。反应总体系（25 μL）：Premix Ex Taq 11.5 μL，双蒸水9.5 μL，DNA模板3 μL，上、下游引物各0.5 μL。循环参数：热盖5 min，94℃预变性5 min；94℃变性40 s，55℃退火45 s；72℃延伸45 s；35个循环，72℃延伸10 min，16℃保温，于-20℃保存备用。PCR扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，在凝胶成像分析仪上观察电泳结果。

1.2.4 产物的回收、克隆及测序 将PCR产物回收纯化，与pMD18-T vector于16℃连接2 h后，转化于感受态细胞DH5α，在氨苄抗性平板上筛选出可疑阳性克隆株送作序列测定。

表1 引物序列及相关信息

2 结果

2.1 受试菌株对四环素的耐药性检测结果 对耐药性检测结果进行统计分析，结果显示69株鸡白痢沙门菌对四环素的耐药率为62.3%，MIC50值为128 μg/mL，MIC90值为256 μg/mL。具体见表2、表3。

表2 受试菌MIC试验结果统计

表3 四环素抑菌浓度（μg/mL）结果统计

2.2 受试菌株耐药基因检测结果 经PCR和琼脂糖凝胶电泳分析，69株鸡白痢沙门菌仅扩增出tet（A）1种耐药基因，检出率为75.4%(52/69)，未能检出耐药基因tet（B）、tet（C）、tet（M）和tet（X）。在43株对四环素耐药的鸡白痢沙门菌中，有39株携带tetA基因，符合率为90.7%。BLAST比对测序结果表明，所扩增出的tetA基因与GenBank数据库中目的基因序列的相似性大于98%。耐药基因tetA PCR产物电泳结果见图1。

3 讨论

3.1 鸡白痢沙门菌对四环素的耐药性 各种抗生素的广泛应用导致鸡白痢沙门菌及其他细菌对抗菌药物的耐药问题已经十分严重[3]。鸡白痢沙门菌的耐药性研究已在国外得到了高度关注，国内的相关研究资料尚需要丰富。潘志明等[4]报道了20世纪80年代江苏省鸡白痢沙门菌对四环素类药物的耐药率上升，20世纪90年代对大部分药物的耐药率可达50%以上，有的甚至达100%。仇莉等对江苏东台区70株鸡白痢沙门菌进行药敏试验，其中对四环素产生了较高的耐药性，耐药率为47.1%；徐君等[5]检测了2008-2009年间从江苏、盐城、南通等地区分离的60株鸡白痢沙门菌的耐药性，结果显示，分离株对四环素的耐药率达63.3%；董洪燕等和严晓玲等[6，7]的检测结果也显示了鸡白痢沙门菌对四环素耐药的严重性，耐药率分别为88%和100%。以上研究均表明，鸡白痢沙门菌的耐药问题已日益突出，对当前食品安全和公共卫生领域构成严重的威胁。本研究检测69株鸡白痢沙门菌对四环素的耐药情况，结果显示，有43株分离菌株产生了耐药，耐药率达62.7%，四环素的MIC50值为128 μg/mL，MIC90值均为256 μg/mL，表明珠三角地区的鸡白痢沙门菌对四环素的耐药情况比较严重，与现有研究报道结果相一致。

3.2 鸡白痢沙门菌对四环素耐药基因的携带情况研究报道表明，tet（A）基因主要位于结合性质粒或者Tn1721等转座子上，该基因在对四环素耐药的沙门菌中广泛分布，当tet基因成为这些可移动遗传成分的一部分，如质粒和转座子，它们将很容易从一个细菌转移到另外一个[8]。本研究的结果表明，对四环素耐药的鸡白痢沙门菌中所携带的四环素耐药基因仅有tet（A）基因，与其他研究结果一致。王晓泉等[9]研究认为，18株鸡白痢沙门菌仅含有tetA基因，尚有研究称通过调查tet基因在鸡源沙门菌中的流行性证实，tet（A）基因是鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌惟一的四环素耐药基因。提示tet(A)基因在鸡白痢沙门菌中分布非常广泛，鸡白痢沙门菌对四环素的耐药机制以tet（A）基因介导的主动外排为主。

[1]涂玉蓉，陈建红，任涛，等.基于等位基因特异性PCR原理建立鸡白痢沙门氏菌PCR方法[J].中国畜牧兽医，2011，38（5）:93-96.

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[4]潘志明，焦新安，唐丽华，等，鸡白痢沙门菌耐药性的变化趋势[J].中国预防兽医学报，1999，21（4）：305-307.

[5]徐君，仇莉，钱新民，等，江苏部分地区鸡白痢沙门菌的耐药性分析[J].中国家禽，2010(11):57-58.

[6]董洪燕，李鑫，曹宇凡，等，鸡白痢沙门菌分离株的耐药性及磺胺类耐药机制研究[J].中国家禽，2010（9）:29-33.

[7]严晓玲，邵红.鸡白痢沙门菌临床分离株的耐药性分析[J].黑龙江八一农垦大学学报，2012(2)：23-26.

[8]Pezzella C，Ricci A，DiGiannatale E，et al.Tetracycline and streptomycin resistance genes，transposons,and plasmids in Salmonella enterica isolates from animals in Italy[J].Antimicrob Agents Chemother，2004，48(3):903-908.

[9]王晓泉，王彦红，吴双，等.四环素耐药基因在鸡源沙门氏菌中的分布和传播[J].中国家禽，2007（9）:10-12，18.