非小细胞肺癌314例EGFR基因突变的研究

田 辉，于凯忠，毛争春，金成华，潘海彬，杨 曦，黄晓燕，沈韦羽*

(1宁波市医疗中心李惠利医院胸外科，宁波 315041;2宁波市医疗中心李惠利医院中心实验室;*通讯作者，E-mail:nblhlswy@163.com)

近年来肺癌的发病率和死亡率迅速上升，跃居肿瘤第一位，其治疗也成为人们关注的焦点。其中以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)为靶点的靶向治疗方法以其较好的特异性和较小的副作用逐渐被肿瘤学术界和广大患者所重视。

EGFR是一种受体型酪氨酸激酶，在许多肿瘤中过表达和/或发生突变，通过信号转导控制肿瘤生长，并与新生血管生成、肿瘤的侵袭和转移等有密切的关系［1］。以EGFR为靶点的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)的药物(如厄罗替尼和吉非替尼)在非小细胞肺癌，特别是在肺腺癌的治疗中显示出很好的抗肿瘤的疗效，但并非所有使用该药的肺癌患者都能受益［2］。近期的研究发现EGFR的基因的19和21外显子的突变与TKIs的疗效密切相关，不同外显子的突变将导致蛋白的构象变化，改变和增强蛋白的活性，增强对TKIs的敏感性［3］。本研究检测了314例中国大陆非小细胞肺癌患者的EGFR突变情况，并与部分国外报道的数据进行比较，同时分析EGFR突变与其临床特征间的关系，旨在为筛选最合适的病人进行有针对性的靶向治疗提供依据，避免不合理用药。

1 材料与方法

1.1 材料

收集宁波李惠利医院2012－06～2013－11间胸外科手术切除并经病理确诊的非小细胞肺癌标本314例，其中男性199例，女性115例;年龄34－82岁，中位数61岁;有吸烟史的病人191例;根据ICC 1997年新的修订标准进行TNM分期，Ⅰ期89例，Ⅱ期87例，Ⅲ期116例，Ⅳ期22例;所有患者术前均未接受过放化疗和EGFR－TKI治疗等抗肿瘤治疗。所有标本均用装有RNAlater(QIAGEN Catalog no.76106)的冻存管保存于4℃，并于2 d内送到实验室进行检测。

1.2 方法

采用PCR扩增和测序法分析肺癌患者手术组织中EGFR外显子19，21突变情况。手术组织DNA提取采用PROMEGA Wizard®基因组DNA纯化试剂盒并按说明书步骤进行。取15 ml离心管一只，加入600μl核裂解液，10－20 mg组织，使用小型匀浆机匀浆10 s。65℃孵育该裂解物15－30 min。待样品达到室温后，加入200μl蛋白沉淀液并使用涡旋振荡器高速剧烈振荡20 s。置于冰上冷却5 min。(13 000－16 000)×g离心4 min，可形成白色致密的蛋白沉淀。在一个干净的1.5 ml小离心管中，加入600μl室温异丙醇。移取上步中含DNA的上清至此小离心管。轻轻颠倒混匀溶液，直至白色线状DNA形成块状沉淀。(13 000－16 000)×g室温离心1 min。可见白色小块状DNA沉淀。小心弃去上清。加入600μl室温70%乙醇，轻轻颠倒离心管数次清洗DNA沉淀，(13 000－16 000)×g室温离心1 min。使用加样枪头小心吸走乙醇溶液。将离心管倒置在干净的吸水纸上，自然干燥10－15 min。向离心管中加入100μl DNA Rehydration Solution，65℃孵育30 min溶解DNA。取2μl测定浓度和纯度，其余储存于－80℃。通过PCR方法扩增EGFR基因外显子19和21，exon19引物序列分别为上游:5’－GCAATATCAGCCTTAGG－3’，下游:5’－TCCAGACATGAGAAAAGG－3’;exon21上游:5’－TTCTTTGGATCAGTAGTCAC－3’，下游 5’－CATGTGTTAAACAATACAGC－3’。具体操作方法参照试剂盒(PROMEGA GoTaq® GreenMaster Mix)说明进行。最后在ABI3730测序仪上机测序。

1.3 统计学分析

采用SPSS13.0软件对率的数据进行χ2检验。

2 结果

2.1 EGFR基因突变特点

在314例肺癌标本中，共检测到EGFR基因突变120例(38.2%)。其中外显子19检测到EGFR基因突变51例(42.5%);外显子21检测到EGFR基因突变69例(57.5%);未见外显子19和外显子21的双突变。其中，外显子19的突变以del E746－A750型为主，有35例(29.1%)，而del L747－A750型突变有11例(9.1%)，其他突变类型5例;在本组病例中，69例外显子21的L858R型突变有65例(54.1%)，L861Q 型的突变有4 例(3.3%，见表1)。

2.2 EGFR基因突变与临床特征的关系

在这314例病例中，男性患者的EGFR突变率为21.1%(42/199)，明显低于女性患者(67.8%，78/115，P＜0.05)。无吸烟史者EGFR基因突变发生率为 58.5%(72/123)，有吸烟史者为 25.1%(48/191)，二者比较差异有统计学意义(P＜0.05，见表2)。TNM分期Ⅰ期EGFR基因突变发生率为39.2%，Ⅱ期为 35.6%，Ⅲ期为 38.8%，Ⅳ期为40.9%，组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 EGFR基因突变特点Table 1 Distribution of EGFR gene mutation

表2 EGFR基因突变与临床特征关系 例(%)Table 2 Correlation between EGFR gene mutation and clinical features cases(%)

3 讨论

Lynch 等［3］和 Paez等［4］报道了酪氨酸激酶抑制剂EGFR－TKI对非小细胞肺癌的疗效与EGFR外显子的突变明显相关。EGFR基因共28个外显子，其中编码酪氨酸激酶区的是第18－21外显子。对EGFR基因突变的数据分析表明，尽管突变部位分散在整个酪氨酸激酶编码区，但89%的突变集中在第19外显子的缺失和第21外显子的L858R点突变［5］，且突变多发生于于腺癌、非吸烟和女性肺癌患者［6］。美国非小细胞肺癌的患者中只有约10%有EGFR的基因突变，但是在亚洲人中，约30%的非小细胞肺癌患者有EGFR的基因突变［7，8］。本研究发现，在中国的 NSCLC 患者中，38.2%(120/314)的患者存在EGFR外显子19或/和21的突变，EGFR的突变状态与患者的性别、吸烟状况有关;女性、非吸烟者中EGFR外显子19、21的突变率显著高于其他患者，是选用TKIs治疗的优势人群，这与国外文献报道相符［3］。

以往的研究［3，4］表明，EGFR 外显子 21 的L858R和外显子19的缺失突变占突变的绝大多数，被认为是活化性突变。外显子21的L858R单核苷酸的替换突变靠近保守的Asp-Phe-Gly序列，突变使活化颈环(activation-loop)的稳定性增加。而外显子19的缺失突变靠近alpha-C-helix(羧基端α螺旋结构域)，而后者控制着与ATP结合囊的角度，突变使ATP 结合囊变窄［9］。Lynch 等［3］认为这两种突变增强了EGFR与ATP或其竞争性抑制剂吉非替尼的相互作用。因此，有EGFR基因突变的患者表现出对吉非替尼更好的治疗反应。Mitsudomi等［10］注意到两种突变在使用TKIs后的反应有差异:在使用厄洛替尼或吉非替尼后，EGFR外显子19缺失突变的患者有效率高于具有L858R突变的患者，且生存时间较L858R突变患者长。

综上所述，由于NSCLC中EGFR基因突变与TKIs治疗敏感性显著相关，因此在肺癌的个体化治疗中应检测EGFR基因的突变，并根据EGFR突变情况来选择用药，以避免患者因使用无效的药物而承担高额的医疗费用和耽误治疗时间。

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