腹泻型肠易激综合征患者结肠肥大细胞与症状相关性研究

秦 斌，郭晓燕，董 蕾，戴 菲，赵菊辉，李 路

(西安交通大学医学院第二附属医院消化内科，西安 710004;*通讯作者，E-mail:dong556@126.com)

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是常见的功能性胃肠疾病之一，表现为腹痛，腹部不适及排便性状的改变，发病原因尚不明确。参与IBS发生的可能病理生理过程包括内脏敏感性增高、脑肠轴功能改变、精神心理因素、肠道炎症等［1］。肥大细胞作为免疫细胞贮存和分泌多种生物活性介质，包括组胺、5－羟色胺、前列腺素、P物质和细胞因子等，通过调节肠黏膜的局部免疫及黏膜通透性参与IBS的发生［2］。大量研究证实肥大细胞在IBS患者结肠黏膜中数目发生改变，但结果不一。多项研究证实在腹泻型肠易激综合征(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，D-IBS)患者肠道中肥大细胞计数明显高于正常人［3，4］，且肥大细胞脱颗粒产物组胺、白介素等水平增高［5］。但肥大细胞计数与临床症状的相关性尚无统一结论。因此本实验通过研究肥大细胞与IBS临床症状的相关性以探讨肥大细胞的可能作用。

1 资料与方法

1.1 对象与材料

根据功能性胃肠疾病罗马Ⅲ诊断标准选取2011－10～2013－12西安交通大学第二附属医院消化内科门诊腹泻型IBS患者34例，健康对照15例。纳入标准:无消化道症状及体征;既往有结肠息肉内镜切除史或结直肠癌家族史;要求行结肠镜检查。排除标准:过敏性疾病(哮喘，过敏性紫癜等);近期肠道感染病史或其他部位感染病史;严重系统疾病;2周内有服药史。

PENTAX电子肠镜由西安交通大学第二附属医院消化内科提供;人肥大细胞类胰蛋白酶(MCT)抗体购自Abcam公司，TRITC标记的荧光二抗购自中杉金桥公司，DAPI染剂购自Sigma公司。MCT酶联免疫试剂盒购自美国R＆D公司，荧光染色图像采集使用NikonECLPSE TE2000－U系统。所有研究对象均知情同意，并且本研究获得西安交通大学第二附属医院伦理委员会批准。

1.2 患者症状评分及取材

IBS患者均行腹痛程度评分，评分标准:0分为无腹痛症状;1分为腹痛轻微，不影响日常活动;2分为腹痛较轻，需要费劲才能忽视，日常活动尚不需要调整;3分为腹痛较重，日常活动受影响且需要调整;4分为腹痛严重，不能参加日常活动。并记录其他临床信息。所有的研究对象均进行结肠镜检查。内镜下无阳性表现者在距离肛门20－30 cm的乙状结肠取活检组织4块，迅速置于液氮后放入－70℃冰箱保存。

1.3 肥大细胞计数

取1块肠结肠黏膜标本立即用10%甲醛固定8 h后置于30%蔗糖溶液4－6 h，OCT胶包埋后于冰冻切片机上切片，切片厚度为5μm。采用间接免疫荧光法对肠黏膜类胰蛋白酶进行染色，MCT一抗孵育过夜后加入荧光二抗37℃孵育1 h。随机连续计数3个高倍视野(400倍)内MC数量，取平均值。为确定MCT细胞内定位，二抗孵育结束后加入DAPI染液约3 min。

1.4 类胰蛋白酶含量测定

3块肠黏膜活检标本称重后、生理盐水里漂洗、在2 ml Hank平衡盐溶液置于37℃下孵育1 h，离心后取50μl上清液，采用酶联免疫吸附试验法测定类胰蛋白酶水平，根据试剂盒说明书操作。每组标本测量重复2次，取平均值，组胺浓度以μg/g组织质量计算。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 一般临床资料的比较

共纳入腹泻型肠易激综合征(D－IBS)患者34例，其中男性12例，女性22例，平均年龄(41±6.5)岁;纳入健康对照15例，其中男性6例，女性9例，平均年龄(45±7.2)岁。健康对照包括3例无症状查体者，8例结肠息肉治疗后复查者，4例有结直肠癌家族史，健康对照者均无消化道症状。所有纳入者结肠镜检查均无阳性发现。

2.2 结肠肥大细胞分布及计数的比较

通过免疫荧光染色发现类胰蛋白酶阳性的肥大细胞主要分布于健康对照和D－IBS患者结肠黏膜的固有层(图1，见第668页)，位于黏膜层腺体之间，在黏膜上皮和腺体内分布很少。使用类胰蛋白酶对肥大细胞标记(图2A，见第668页)后，用DAPI对细胞核染色(图2B，见第668页)发现类胰蛋白酶位于肥大细胞胞质(图2C，见第668页)。通过对肥大细胞计数统计学比较发现腹泻型肠易激综合征患者肥大细胞计数明显高于正常对照(P=0.004，见表1)。

表1 D-IBS患者与健康对照肥大细胞计数及类胰蛋白酶含量的比较Table 1 Comparison of mast cell counts and MCT contents between D-IBS patients and healthy controls

2.3 腹泻型IBS肥大细胞与症状相关性的比较

所有腹泻型IBS患者均出现腹痛、腹泻症状，腹痛程度的评分为(1.94±0.89)分，平均病程为(61.2±52.0)月。通过与肥大细胞计数的相关性分析发现腹泻型IBS患者腹痛程度与肥大细胞计数呈正相关(r=0.35，P=0.04)，而肥大细胞计数与病程无明显相关性(r=0.15，P=0.38，见图3)。

2.4 肠黏膜类胰蛋白酶水平的比较

本实验通过ELISA发现肥大细胞脱颗粒产物组胺在健康对照结肠黏膜的浓度为(0.045±0.018)μg/g组织，在腹泻型肠易激综合征患者结肠黏膜的浓度为(0.083±0.025)μg/g组织，通过统计学比较本实验发现D－IBS组胺水平明显高于健康对照(P＜0.01，见表1)。

3 讨论

肠易激综合征主要变现为腹痛、大便习惯改变等症状，病因和发病机制尚不清楚，在肠易激综合征患者肠黏膜很少发现病理改变。大量的研究证实了肥大细胞在肠易激综合征特别是腹泻型患者中增多，提示肥大细胞在肠易激综合征发病中发挥作用。本研究证实D－IBS患者肠黏膜肥大细胞增多与腹痛程度相关，同时肥大细胞产物类胰蛋白酶含量增高。肥大细胞通常通过参与肠道炎症和过敏反应在肠道疾病中发挥作用，而肥大细胞活化后会释放类胰蛋白酶、组胺、白三烯、P物质等产物，这些炎症因子会通过与肠道黏膜受体结合调节内脏感知、运动等生理过程。

本实验通过免疫荧光染色发现肥大细胞在DIBS患者中增高，这与以往的研究结果一致［3］。说明肥大细胞增多是IBS患者肠道发生的病理改变之一。但是肥大细胞增加的机制尚不明确，原因之一可能与肠道黏膜免疫反应有关，当肠道存在食物过敏、肠道感染等抗原刺激时，肥大细胞作为抗原感受器参与肠道黏膜的免疫调节，这在以往的研究中已经证实［6］。另一个可能的机制与心理应激有关，当应激发生时，CRF分泌增加并直接作用肠黏膜肥大细胞促使其释放活性介质［7］，多个动物实验发现应激可以引起肠黏膜肥大细胞的增加，提示肥大细胞参与脑肠轴对内脏敏感性的调节［8］。

本研究发现肥大细胞主要位于结肠黏膜固有层腺体之间，这与肠道神经纤维分布一致，已有研究证实肥大细胞与肠黏膜神经纤维的距离与肠易激综合征的发生有关［9］。同时肠道神经存在肥大细胞产物的受体，当这些受体活化后可以通过多种方式参与内脏感知和运动的调节，如组胺可以作用于神经纤维的H1受体改变肠道的肌电活动［10］，而肥大细胞直接分泌的化学介质间接改变肠道神经原的痛觉阈值并引起腹痛的发生［11］。本实验通过酶联免疫吸附实验发现肥大细胞产物之一的类胰蛋白酶在结肠黏膜含量增多，而类胰蛋白酶主要分布于肥大细胞，它可以作用于蛋白激活酶受体PAR-2发挥作用［12］。而有研究发现PAR-2表达于肠道神经元，其活化后通过信号转导参与调节内脏感知，肠黏膜通透性以及肠道动力等生理过程［13］。

本实验通过统计发现结肠黏膜肥大细胞增多与D-IBS患者腹痛的程度有关，提示肥大细胞可能通过调节内脏敏感性参与IBS的发生，而近期一项临床研究证实肥大细胞膜稳定剂酮替芬可以缓解肠易激患者腹痛等症状［14］，而多项动物实验也证实当肥大细胞活化后大鼠内脏敏感性增加［15，16］，这充分说明了肥大细胞脱颗粒产物促进腹痛的发生。但是本实验并未发现肥大细胞计数与D－IBS患者的病程有相关性，研究者推测肠易激综合征患者肠黏膜肥大细胞活化是一过性的反应，只有存在感染、心理应激时才会出现，当这些诱发因素消失时，并不出现累积性的效应，因此与病程的长短并无关联。

本研究证实了腹泻型肠易激综合征患者结肠黏膜肥大细胞明显高于健康对照，同时发现这与腹痛严重程度有关，肥大细胞可能通过活化后其类胰蛋白酶等产物含量增高调节内脏感觉而参与肠易激综合征的发生。因此，肥大细胞稳定剂等以肠道肥大细胞作为靶点的药物为肠易激综合征患者提供了新的治疗选择。

图3 肥大细胞计数的比较及与D－IBS患者症状相关性的比较Figure 3 Comparison of mast cell counts between D-IBSpatients and healthy controls，and its correlation with symptoms in D-IBSpatients

［1］Zhong L，Hou X.Pathophysiologic findings of irritable bowel syndrome in china［J］.J Neurogastroenterol Motil，2012，18(1):19－33.

［2］Vivinus-Nebot M，Dainese R，Anty R，etal.Combination of allergic factors can worsen diarrheic irritable bowel syndrome:role of barrier defects and mast cells［J］.Am JGastroenterol，2012，107(1):75－81.

［3］Park JH，Rhee PL，Kim HS，etal.Mucosal mast cell counts correlate with visceral hypersensitivity in patients with diarrhea predominant irritable bowel syndrome［J］.J Gastroenterol Hepatol，2006，21(1):71－78.

［4］Guilarte M，Santos J，de Torres I，etal.Diarrhea-predominant IBS patients show mast cell activation and hyperplasia in the jejunum［J］.Gut，2007，56(2):203－209.

［5］Han W，Lu X，Jia X，etal.Soluble mediators released from PIIBSpatients＇colon induced alteration of mast cell:involvement of reactive oxygen species［J］.Dig Dis Sci，2012，57(2):311－319.

［6］Matricon J，Meleine M，Gelot A，etal.Review article:Associations between immune activation，intestinal permeability and the irritable bowel syndrome［J］.Aliment Pharmacol Ther，2012，36(11－12):1009－1031.

［7］Larauche M.Novel insights in the role of peripheral corticotropinreleasing factor and mast cells in stress-induced visceral hypersensitivity［J］.Neurogastroenterol Motil，2012，24(3):201－5.

［8］Konturek PC，Brzozowski T，Konturek SJ.Stress and the gut:pathophysiology，clinical consequences，diagnostic approach and treatment options［J］.J Physiol Pharmacol，2011，62(6):591－599.

［9］Barbara G，Stanghellini V，De Giorgio R，etal.Activated mast cells in proximity to colonic nerves correlate with abdominal pain in irritable bowel syndrome［J］.Gastroenterology，2004，126(3):693－702.

［10］Buhner S，Li Q，Vignali S，Barbara G，etal.Activation of human enteric neurons by supernatants of colonic biopsy specimens from patients with irritable bowel syndrome［J］.Gastroenterology，2009，137(4):1425－1434.

［11］Barbara G，Wang B，Stanghellini V，etal.Mast cell-dependent excitation of visceral-nociceptive sensory neurons in irritable bowel syndrome［J］.Gastroenterology，2007，132(1):26－37.

［12］Bueno L.Protease activated receptor 2:a new target for IBStreatment［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2008，12(Suppl 1):95－102.

［13］Wilcz-Villega EM，McClean S，O’Sullivan MA.Mast cell tryptase reduces junctional adhesion molecule－A(JAM－A)expression in intestinal epithelial cells:implications for the mechanisms of barrier dysfunction in irritable bowel syndrome［J］.Am J Gastroenterol，2013，108(7):1140－1151.

［14］Klooker TK，Braak B，Koopman KE，etal.The mast cell stabiliser ketotifen decreases visceral hypersensitivity and improves intestinal symptoms in patients with irritable bowel syndrome［J］.Gut，2010，59(9):1213－1221.

［15］王伟岸，钱家鸣，潘国宗，等.结肠黏膜肥大细胞活化在肠易激综合征发病中的作用［J］.中华消化杂志，2003，23(5):263－266.

［16］陈丽珠，王承党.肥大细胞相关介质在肠易激综合征发病机制中的作用［J］.国际消化病杂志，2010，30(6):325－328.