加味导赤散与维生素B12联合灌胃对大鼠复发性口腔溃疡模型外周血T淋巴细胞亚群的影响

李 婧，武云霞，管翠强，郭洪波(山西医科大学第一临床医学院口腔科，太原 03000;山西医科大学第一临床医学院中医科;通讯作者，E-mail:383455695@63.com)

复发性阿弗他溃疡(recurrent aphthous ulcer，RAU)又称为复发性口腔溃疡(recurrent oral ulcers，ROU)，是口腔科最常见的黏膜疾病之一。普通人群中发病率可高达20%，居口腔黏膜病之首。该病反复发作、具有明显灼痛感，严重影响患者的生活质量［1］，由于其致病机制不明且影响因素颇多，故目前没有针对性治疗的有效药物。西医药效局限，毒副作用明显，不宜长期使用。中药治疗口腔溃疡的方法可谓多元化，注重全身治疗与局部治疗相结合，寻找一种效果显著、副作用低、价格低廉、易于制剂的中药是目前的研究方向之一。近年来研究表明ROU属于一种自身免疫性疾病。实验证明，T淋巴细胞亚群的数量和功能异常可以引起溃疡病发生［2］。提示患者RAU的发生与细胞免疫功能下降和T淋巴细胞亚群失衡可能具有一定的相关性。Ujevic等提出叶酸和维生素B缺乏是复发性口腔溃疡的诱因，补充维生素可预防口腔溃疡的发生［3］。本课题目的是建立复发性口腔溃疡模型，并观察加味导赤散与维生素B12对模型大鼠外周血淋巴细胞亚群的影响，以探索其对ROU模型免疫功能的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

完全弗氏佐剂，美国Sigma公司。anti-CD4+-FITC和anti-CD8+-FITC由大连泛邦化工技术开发有限公司提供。维生素B12片，山西利丰华瑞制药有限责任公司。左旋咪唑片，广州白云山光华制药股份有限公司。流式细胞仪，山西医科大学实验中心。组织匀浆器，武汉博士德生物有限公司提供。恒温水浴箱，北京医疗设备厂。

1.2 动物分组

清洁级 Sprague-Dawley(SD)大鼠44只，体重180-200 g，雌雄各半，12只脱颈处死取黏膜备用。32只随机分为正常组、溃疡组、左旋咪唑组、加味导赤散+维生素B12组，每组8只。

1.3 中药制备

加味导赤散:竹叶15 g、生地黄10 g、通草10 g、生甘草6 g、生石膏30 g。由山西医科大学第一临床医院中药房熬制，并分装灭菌，4℃冰箱备用。灌胃前，50-60℃恒温水浴下浓缩为生药浓度为1 g/ml药液，按人鼠等效剂量换算，大鼠用量为1.278 g/200 g，即以 1.278 ml/200 g，每天一次灌胃。

1.4 SD大鼠ROU模型建立

1.4.1 抗原乳化液的制备 12只大鼠脱颈处死，无菌条件下剥取口腔黏膜组织，冰浴下组织匀浆器匀浆，加入0.1 mol/L，pH 7.4的 PBS缓冲液。 -70℃冰箱备用。每次免疫动物时，加入等量完全弗氏佐剂，制备成抗原乳化液。

1.4.2 ROU模型的建立 24只 SD大鼠(除8只正常组)脊柱两侧皮内共注射2-3点抗原乳化液，每隔2周一次，共注射5次。在第三次注射抗原乳化液后一周所有模型组大鼠均出现口腔溃疡。模型建立参考程茜等［4］造模方法。

1.5 给药方法

第三次注射抗原乳化液后一周，左旋咪唑片按20 mg/kg灌胃;维生素 B12按20 μg/kg和加味导赤散一起灌胃，1次/d，连续20 d。治疗完成后分别从各组大鼠眼眶取血，流式细胞仪检测大鼠外周血CD4+、CD8+细胞数量以及 CD4+/CD8+。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 各组溃疡组织变化

大鼠在第3次注射抗原一周后均出现口腔溃疡。多发生在上下唇，圆形或椭圆形，边缘较整齐，黄白色伪膜覆盖。直径约2-5 mm，3-5 d愈合，后又复发。灌胃20 d后HE染色光镜观察:模型组中上皮溶解破溃，淋巴细胞浸润，固有层内大量中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞浸润，毛细血管充血扩张。左旋咪唑组和加味导赤散+维生素B12组的溃疡组织上皮及固有层内炎症细胞数量比模型组有所减少(图1，见第668页)。

2.2 流式细胞仪CD4+、CD8+的检测结果

与正常组相比，溃疡形成后CD4+细胞数量、CD4+/CD8+较正常对照组均降低，具有统计学差异(P＜0.05);CD8+细胞数与正常对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。左旋咪唑组与加味导赤散+维生素B12组CD4+、CD4+/CD8+与模型组相比均有回升，差异有统计学意义(P＜0.05)，两用药组之间差异没有统计学意义(P＞0.05，见表1)。

表1 各组实验大鼠外周血中T细胞亚群的变化(±s)Table 1 Changes of peripheral blood T-lymphocyte subsets in rats with ROU(±s)

表1 各组实验大鼠外周血中T细胞亚群的变化(±s)Table 1 Changes of peripheral blood T-lymphocyte subsets in rats with ROU(±s)

与正常组比较，△P ＜0.05;与溃疡组比较，*P ＜0.05

组别 n CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+正常组844.65 ±1.75 20.21 ±2.23 2.21 ±0.12溃疡组 8 35.28 ±2.37△ 21.76 ±1.38 1.68 ±0.32△左旋咪唑组 8 40.24 ±2.28* 22.87 ±1.42 1.77 ±0.14*加味导赤散 +维生素 B12组 8 43.54 ±3.71* 20.13 ±2.35 2.15 ±0.25*

3 讨论

近代研究表明，ROU属于一种自身免疫性疾病［1］。黄华峰等检测了同一ROU患者在溃疡期和溃疡缓解期外周血T细胞亚群的变化，并与正常人进行了比较，表明在溃疡期患者T细胞亚群分布与正常人有一定差别［5］。近年来，大量实验研究皆证实了ROU患者外周血有不同程度的CD4+细胞数量下降及 CD4+/CD8+比值下降［6，7］，与本实验研究一致。提示ROU患者机体免疫功能的异常改变之一是T细胞亚群的平衡失调。

淋巴细胞是构成机体免疫系统的主要细胞群体，其中T淋巴细胞在机体防御初期起着非常重要的作用，T细胞有多个亚群，其中CD4+为T辅助—诱导亚群，CD8+为T杀伤—抑制亚群，两者共同对免疫应答进行调节，CD4+功能之一是可诱导CD8+T淋巴细胞抑制免疫球蛋白G的合成和特异性抗体产生，所以CD4+细胞的减少可能导致患者对致病物敏感性提高以及非正常的自身免疫反应。［8］

复发性口腔溃疡在中医学里称“口疮”“口疡”“赤口疮”等。中医认为本病主要由心经热盛，且心热移至小肠所致。导赤散出自宋代钱乙的《小儿药证直诀》，由生地、木通(关木通)、甘草、淡竹叶组成，为体现清热利水养阴治法的基础方。《医方考》上记载:“是方也，生地黄可以凉心，甘草梢可以泻热;佐之以木通，则直走小肠、膀胱矣。名曰导赤者，导其丙丁之赤，由溺而泄也”。中医可根据四诊八纲，通过加减味辨证施治。本实验加味导赤散是以通草易关木通再加生石膏而成，配伍严谨，既延续了导赤散利水而不伤阴之精髓，又增加了其清热泻火之力。且现代医学研究认为，导赤散中生甘草有抗炎、调节免疫的作用［9］;竹叶具有扩张毛细血管、疏通微循环等功效［10］;且竹叶，生地含有钾、镁、锰、锌等多种微量元素［11，12］。通草和石膏中含有的锌等微量元素也与 ROU 密切相关［13，14］。维生素 B12对口腔溃疡病损有修复、加速新生组织生长和调节免疫的作用［15，16］。各种药物相合，既能清热凉血，而又利水通淋，临床上亦起到促进溃疡愈合、提高口腔黏膜局部免疫功能、延缓复发的作用。

本实验以左旋咪唑组作为阳性对照组，用药后左旋咪唑组和加味导赤散+维生素B12组CD4+细胞数量和CD4+/CD8+比值均升高，与健康对照组接近，说明加味导赤散+维生素B12，可有效改善大鼠ROU模型T淋巴细胞亚群失衡，纠正免疫功能紊乱，由此推断加味导赤散加维生素B12对复发性口腔溃疡模型有治疗作用，对于未来治疗口腔溃疡有一定的应用前景。

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