腺病毒介导的白介素-24转移对脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡和周期调节蛋白p21、p27及CyclinE的影响

王晓浪 周建华 王从俊

肾小球系膜细胞(GMCs)异常增殖构成了多种肾小球肾炎发生、发展的主要病理变化，持续的细胞增殖和细胞外基质积聚最终将导致肾小球硬化或肾衰竭，并引起严重的肾功能障碍［1］。GMCs是肾小球内非常活跃的固有细胞，在肾小球炎症与硬化的发病过程中，既是主要的靶细胞，也是病变过程的主要参与者，因此控制GMCs增殖对逆转肾小球损伤和防止其向慢性转变有重要的意义。

IL-24主要由外周血单个核细胞、胸腺、脾脏等免疫器官和分化的黑色素细胞表达［2］，具有较明显的抗肿瘤作用，能选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长［3～5］。本研究前期实验已证实 IL-24可有效转染进入GMCs并稳定表达，且对正常生长GMCs无影响［6］。本研究进一步观察了IL-24转移对脂多糖(LPS)诱导的GMCs凋亡的影响，并通过研究IL-24转移对LPS诱导的GMCs周期调节蛋白p21、p27及CyclinE的影响，试图探讨IL-24抑制GMCs增生的可能途径，为临床治疗系膜增生性肾小球肾炎提供新的思路。

1 方法

1.1 细胞与腺病毒载体来源 腺病毒载体(美国Gene公司)、永生化293细胞系(华中科技大学同济医院普外科惠赠)、SV40病毒转染后永生化的大鼠GMCs(武汉大学中国典型培养物保藏中心)。

1.2 试剂与仪器 新生牛血清(FBS)、DMEM、0.25%胰酶(美国Gibco公司);IL-24 ELISA试剂盒(美国R＆D公司);RT逆转录反应试剂盒(Fermentas公司);CyclinE、p27兔抗鼠多克隆抗体(武汉博士德公司)、actin、p21兔抗鼠多克隆抗体(北京中杉公司)、二抗羊抗兔多克隆抗体(深圳晶美公司)、Annexin V/FITC凋亡检测试剂盒(深圳晶美公司)。超净工作台(SW-CJ-1F型，苏净集团安泰空气技术有限公司)。CO2培养箱(BB16/BB5060型，美国 Heraeus公司)，倒置显微镜(IX70型，日本Olympus公司);台式离心机(LDZ5-2型，北京医用离心机厂);低温高速离心机(AnantiTMJ-25型，Beckman公司);流式细胞仪(FACSCalibur型，美国BD公司)。

1.3 IL-24腺病毒载体扩增 用10%FBS/DMEM培养293细胞，扩增腺病毒载体。

1.4 GMCs的培养 GMCs常规用含10%FBS/DMEM培养液培养，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，2～4d换液传代1次，取4～6代细胞用于后续研究。

1.5 IL-24对LPS诱导的GMCs凋亡的影响

1.5.1 分组和腺病毒转染 分为对照组、Ad.IL-24组、LPS组和LPS+Ad.IL-24组，其中对照组和LPS组不转染GMCs，Ad.IL-24组和LPS+Ad.IL-24组以每细胞102个携带IL-24腺病毒颗粒转染GMCs。4组均取对数生长期的GMCs接种于6孔板，培养24h待细胞达到亚融合状态，GMCs用维持液同步化24h后，对照组和Ad.IL-24组予5%FBS/DMEM培养，LPS组和LPS+Ad.IL-24组在此基础上添加10mg·L-1LPS培养。4组分别提取培养24、48h的GMCs或上清备用。

1.5.2 细胞凋亡分析 各组培养后24和48h GMCs用预冷的PBS洗2次，胰酶消化，800 r·min-1离心5 min收集细胞，PBS洗1次，用结合缓冲液重悬细胞，调整浓度106·mL-1，取100μL细胞悬液于流式管中加入5μL膜联蛋白V-FITC 标记和 10μL(20μg·mL-1)的碘化丙啶，混匀后于室温避光15 min后采用流式细胞仪检测，重复试验3次，结果采用Cell-Quest分析。

1.6 IL-24对GMCs周期蛋白的影响

1.6.1 分组和腺病毒转染 对照组和Ad.IL-24+LPS组的处理同1.5.1项下，Ad-GFP组采用携带绿色荧光蛋白的对照载体转染，以5%FBS/DMEM+10mg·L-1LPS培养。3组均取培养后24和48h GMCs样本或上清备用。

1.6.2 Western-blot检测GMCs周期蛋白 收集细胞提取抗原蛋白，行蛋白定量，用 Western-blot检测 p21、p27及CyclinE，结果采用Gel-2000分析，按照说明书进行操作。

2 结果

2.1 IL-24对LPS诱导的GMCs凋亡的影响 各组培养后的流式细胞术检测结果如图1所示。GMCs在培养后24和48h细胞凋亡率:对照组分别为(0.86±0.15)%和(0.98±0.4)%;Ad.IL-24组分别为(1.02±0.22)%和(1.43±0.31)%;LPS组分别为(2.19±0.81)%和(2.49±0.12)%，LPS+Ad.IL-24组分别为(18.01±1.17)%和(26.82±5.01)%。4组细胞凋亡率培养后48h均高于24h;培养后2个观察时间细胞凋亡率4组间差异均总体上有统计学意义(F=13.19，(P＜0.05))，对照组与IL-24组差异无统计学意义，LPS组显著高于对照组(t=6.57，(P＜0.05))，LPS+Ad.IL-24组细胞凋亡率最高(t=12.43，(P＜0.05))。

图1 IL-24对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡的影响(Annexin V/PI双染法)Fig 1 Effects of IL-24 on apoptosis of rat glomerular mesangial cells induced by LPS(Annexin V/PIdoubledye method)

2.2 IL-24对GMCs细胞周期蛋白的影响 Western-blot检测p21、p27及 CyclinE的结果如图2所示，培养后24和48h时点3个周期蛋白差别不显著，进行合并分析。表1显示，Ad-GFP组GMCs负调控周期蛋白p21、p27表达显著低于对照组((P＜0.05))，GMCs正调控蛋白CyclinE表达显著高于对照组((P＜0.05));转染IL-24后的Ad.IL-24+LPS组p21和p27表达较Ad-GFP组均显著上调((P＜0.05))，CyclinE表达较Ad-GFP组下调;3个周期蛋白的表达Ad.IL-24+LPS和对照组的差异均无统计学意义((P＞0.05))。

图2 3组肾小球系膜细胞p21、p27、CyclinE表达的Western-blot检测结果Fig 2 Western-blot results of p21，p27 and CyclinEin 3 groups

Notes P1:Ad-GFP group vs control group;P2:Ad.IL24 group vs control group;P3:Ad.GFP group vs Ad-IL24 group

3 讨论

近年来研究发现细胞凋亡与造血、胚胎发育、肿瘤发生、组织炎症和免疫耐受等有密切关系，这种受细胞主动调控的死亡形式在组织的发育更新、稳态维持和疾病防治中都起重要作用。有研究发现在肾小球肾炎患者中，肾小球中多核白细胞和GMCs有凋亡，凋亡使炎症及增殖反应缓解，而凋亡过程的延迟可促进细胞增殖［7］。这也提示，凋亡是对细胞异常增生的一种矫正，是消除增生细胞的有效途径。本研究观察到，转染Ad.IL-24使LPS诱导的GMCs凋亡率显著增高，而对照组未观察到明显变化，提示IL-24转移可促进异常增生的GMCs凋亡，从而抑制LPS诱导的GMCs增殖。

细胞增殖的调节最终发生在细胞周期水平上，不同的生命体细胞及同一系统中不同细胞的细胞周期不同，一般S+G2+M期的时间变化小，而G1期时间变化较大，G1期是控制细胞生长的阶段，也是细胞周期的关键和限速阶段［8］，p21可广泛抑制各种Cyclin-CDK复合物，故在细胞周期调节和细胞凋亡中具有重要作用［9］。Marshall等［10］报道，将体外培养的足细胞暴露于转化生长因子，检测出其p21表达上调，而相应出现的大量细胞凋亡，而在相同培养环境下的p21-/-足细胞则未发生凋亡。p27是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI)的KIP家族重要成员之一，可抑制多种Cyclin-CDK复合物的活性，对细胞周期进行负调控，抑制细胞分裂和增殖，促进细胞分化和凋亡［11］。研究证实静息期GMCs p27蛋白有高表达，而Thy1型肾炎大鼠p27表达下调，GMCs增殖越明显则p27表达水平越低下［12］。CyclinE是参与细胞周期G1-S转换的重要正性调节因子，在正常细胞和肿瘤细胞中主要在G1晚期发挥正调控细胞周期的作用。本研究结果显示，IL-24转移后GMCs负调控蛋白 p27和p21表达上调，而正调控蛋白CyclinE下调，这可能是 IL-24转移使 LPS诱导增生的GMCs凋亡增加的发生机制。

对于肾小球疾病的治疗无论是抑制还是促进GMCs凋亡都存在一些问题，比如GMCs异常增殖期，采用促GMCs凋亡的药物不但会促进增殖后GMCs的大量凋亡，并且可能会加剧正常GMCs凋亡;而在肾小球硬化晚期针对GMCs大量丢失时采用细胞凋亡抑制药物可能会延缓病变细胞的清除。所以有选择性和可控制性地诱导多余的GMCs凋亡，同时对机体的正常细胞不产生或产生较小的副作用，对于治疗系膜增生性肾小球肾炎将起到重大突破作用。本文结果表明IL-24通过腺病毒载体可有效转移进入GMCs并稳定表达，对正常GMCs无影响;上调p21及p27水平并下调CyclinE表达，使LPS诱导增生的GMCs凋亡增加，有效抑制LPS诱导的GMCs增生，说明腺病毒介导的IL-24转移可能是治疗系膜增生性肾小球肾炎的有效方法，为治疗肾脏疾病提供了理论上的可能。

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