肝细胞癌肿瘤血管生成及其临床病理意义

刘明阁，于庆凯

(河南省肿瘤医院病理科 河南郑州 450003)

实体瘤的生长和转移依赖于血管的生成，肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是富血供的肿瘤，因此影响血管发生及生长的影响因子对HCC的诊断及治疗具有重要意义［1］。近几年来，细胞因子及肿瘤血管形成对肿瘤影响的研究越来越受到重视，本研究主要针对两个因子、一个指标与HCC的关系进行探讨。两个因子:血管组织缺氧诱导因子-1α(Hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF);一个指标:微血管密度(microvessel density，MVD)。其中，根据 CD34阳性的血管内皮细胞计数来测定MVD［2］。本研究旨在探讨HIF-1α的表达、VEGF的表达、MVD之间的相互作用，及其对HCC的病理学意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取河南省肿瘤医院肝胆外科2012年4月至2013年5月期间手术切除并经病理证实HCC的标本66例，其中男性42例，女性24例;年龄36～69岁，平均53.3岁;肿瘤直径≤5 cm 21例，＞5 cm 45例;肿瘤组织发生转移39例，未发生转移27例;按照临床分期:Ⅰ～Ⅱ期41例，Ⅲ～Ⅳ期25例。所有标本均经本院病理科进行固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、贴片、染色、封片等常规步骤。处理步骤、方法之间差异无统计学意义。

1.2 实验方法 标本切片采用免疫组化染色技术，具体流程如下:①甲醛固定，4℃，20%蔗糖溶液过夜;②制作蜡块:常规浸蜡、包埋、切片、贴片操作，PBS清洗(清洗5 min，重复3次);③使用0.3%的过氧化氢甲醇溶液处理30 min，PBS清洗同②;④加入配好的0.3%Triton X-100 溶液处理30 min，PBS清洗同②;⑤加入血清稀释液稀释的一抗，4℃处理24～48 h，吸去抗体，PBS清洗同②;⑥加入PBS处理的二抗，室温处理2 h，PBS清洗同②;⑦加入抗体，室温处理2 h，PBS清洗同②，蒸馏水迅速冲洗3次;⑧加入显色液，进行免疫组织化学显色操作，酒精梯度脱水后，透明、封片、拍照。

1.3 结果判定 HIF-1α经免疫组化染色后，着色部位主要位于胞浆，阳性细胞镜下显示棕黄色颗粒。每计数100个细胞，细胞数大于10记为阳性，无阳性细胞或细胞数小于10记为阴性。VEGF经免疫组化染色后，胞质和胞膜中均可出现棕黄色颗粒，镜下阳细胞数≥30%者记为阳性，＜30%以及无着色者记为阴性。根据CD34阳性的血管内皮细胞计数来测定肿瘤微血管密度(MVD)。首先，在低倍镜下进行初步扫片，选择3个血管丰富的区域作为分析区域。然后，在高倍镜下(×200)计数被染成棕黄色的内皮细胞团簇数目。最后，取3个区域的平均值作为该组织的MVD值［3］。

1.4 统计学处理 所有资料采用SPSS 17.0统计学软件处理，定量资料采用t检验，定性资料采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HIF-1α、VEGF的表达及 MVD值比较 HCC组织的HIF-1α、VEGF表达及MVD值均显著增高，癌症组织与癌旁非肿瘤组织的差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1、表2。

表1 肝细胞肝癌与癌旁非肿瘤组织HIF-1α、VEGF表达阳性率对比［n，(%)］

表2 肝细胞肝癌与癌旁非肿瘤组织MVD值对比(±s)

表2 肝细胞肝癌与癌旁非肿瘤组织MVD值对比(±s)

组别 n MVD值＜0.05 66 40.82±21.40癌旁非肿瘤组织 20 22.20±11.83 t 3.713 P肝细胞癌

2.2 不同病理特征下HIF-1α、VEGF的表达及MVD值的比较 HIF-1α、VEGF、MVD在肝细胞肝癌中的表达与肿瘤大小、AFP值的高低、病理分级无关(P＞0.05)。转移组HIF-1α、VEGF的表达明显高于未转移组(P＜0.01);转移组MVD值显著高于未转移组(P＜0.01)。见表3、表4。

表3 不同病理特征下HIF-1α、VEGF表达的比较

表4 不同病理特征下MVD值的比较研究(±s)

表4 不同病理特征下MVD值的比较研究(±s)

t P肿瘤直径组别 n MVD值1.594 0.112≤5 cm 21 47.11±18.26＞5 cm 45 39.10±19.29 AFP 0.426 0.672≤400 μg/L 20 45.70±6.80＞400 μg/L 46 44.90±7.10肿瘤转移6.517＜0.01

续表4

3 讨论

肝细胞肝癌是全球发病率较高的疾病之一，由于其病情发展迅速、治疗难度大、预后效果差，已成为临床上主要的研究课题［4］。近年来，有学者提出，由于HCC具有丰富的血管供应，其肿瘤血管生成可能与HCC的发生发展有关［5］。因此，本研究对肿瘤血管及其相关因子对HCC的影响进行探讨。

研究认为，MVD值最能够充分反映HCC肿瘤血管的发生、发展过程，本研究以CD34阳性的血管内皮细胞计数来测定MVD值，对其表达及影响因素进行研究。结果显示，MVD在肿瘤组织中具有高表达，且MVD值的高低与肿瘤是否发生转移密切相关，而与肿瘤直径、AFP值及病理分期无关。因此可以推断MVD值可以反映HCC肿瘤血管的生成，并可以作为肿瘤是否发生转移的评价指标。有文献表明MVD能够直接反应肿瘤血管的生成状况，间接反映肿瘤的生长情况、发生浸润和转移的能力［6］，因此本研究结果与文献报道一致。

由于HCC为富血供的实体瘤，缺氧情况明显，并且肿瘤血管的生成需要各种因子的刺激，HIF-1α为重要的缺氧调节因子，VEGF为重要的诱导血管生成的调节因子［7］。因此，本研究对 HIF-1α、VEGF 两个因子进行探讨，并尝试分析两者与MVD值之间的关系。本研究显示:HCC组织的HIF-1α、VEGF的表达显著高于癌旁非肿瘤组织，在发生转移的组织中HIF-1α、VEGF的表达显著高于未发生转移的组织(P＜0.05)，且与肿瘤直径、AFP值及病理分期无关(P＞0.05)。此结果说明HIF-1α、VEGF是HCC肿瘤血管生成重要的调节因子，在临床工作中应给予重视。

此次研究中将MWD值、HIF-1α、VEGF的表达放在一起进行比较，结果显示三者的表达呈正相关，因此可以推断MVD受HIF-1α、VEGF表达的影响与调控，均与肝癌的发生、发展、转移有关。在临床治疗中可以通过减少或抑制HIF-1α、VEGF的表达来减缓肿瘤发展及转移的过程。

另外，本研究中，HIF-1α、VEGF在HCC组织中的表达率分别为83.33%、81.08%，且在发生转移的肿瘤组织中均具有高表达，因此可以推测，HIF-1α与VEGF的表达两者之间可能有相关性，两者相互促进，共同调控肿瘤血管的生成，其临床意义有待进一步研究。

［1］Sato Y.Is vasohibin-1 for more than angiogenesis inhibition［J］.Journal of Biochemistry，2011，149(3):229-230.

［2］Lu C，Han H D，Mangala L S，et al.Regulation of tumorangiogenesis by EZH2［J］.Cancer cell，2010，18(2):185-197.

［3］Zhang L，Wang J N，Tang J M，et al.VEGF is essential for the growth and migration of human hepatocellular carcinoma cells［J］.Molecular biology reports，2012，39(5):5085-5093.

［4］Choedon T，Dolma D，Kumar V.Pro-apoptotic and anticancer properties of Thapring-A Tibetan herbal formulation［J］.J Ethnopharmacology，2011，137(1):320-326.

［5］Okamoto K，Neureiter D，Ocker M，et al.Biomarkers for novel targeted therapies of hepatocellular carcinoma［J］.Histol Histopathol，2009，24(4):493-502.

［6］Patel N S，Muneer A，Blick C，et al.Targeting vascular endothelial growth factor in renal cell carcinoma［J］.Tumour Biol，2009，30(5-6):292-299.

［7］Liu Y，Chen Z，Liu C，et al.Gadolinium-loaded polymeric nanoparticles modified with Anti-VEGF as multifunctional MRI contrast agents for the diagnosis of liver cancer［J］.Biomaterials，2011，32(22):5167-5176.