茄子遗传转化植株再生体系的优化

张明华，陈钰辉，刘富中，张映，连勇

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京，100091）

茄子（Solanum melongena L.）是世界各地广泛栽培的重要蔬菜之一，营养价值丰富，为加快育种进程，国内外已先后从茄子的器官分化[1，2]、花药培养[3]、胚状体诱导[4～6]、原生质体培养[7]、小孢子培养[8，9]子叶与下胚轴离体再生[10～12]等多方面进行了研究。近30 a来，国内的茄子组织培养研究工作取得了很大进展，但是和同科同属的番茄[13]、马铃薯[14]相比，仍有一定距离。茄子再生体系研究面临的一个主要难题就是不定芽分化频率较低，缺少通用稳定的适于茄子遗传转化的植株再生体系。因此探索高效的受体再生途径，建立完善的遗传转化体系是目前的主要任务。本试验在课题组已有茄子离体培养研究的基础上[15]，探讨了不同外植体、激素配比、基因型等因素对茄子离体培养植株再生的影响。通过对植株再生体系的优化，以期得到普遍适用的茄子离体培养再生体系，提高茄子遗传转化率，促进基因工程在茄子改良育种中的应用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试茄子品种为中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育的高代自交系长茄03154、03204，圆茄07683、07675。以种子露白后苗龄10 d的茄子下胚轴、子叶作为外植体。

1.2 无菌苗培养及外植体接种

将茄子种子用75%酒精浸泡30 s，后用无菌水冲洗1次，再用10%NaClO溶液浸泡20 min后用无菌水冲洗3次。接种至附加0.7%琼脂和2%蔗糖的1/2 MS 培养基上，置于（25±1）°C、光照时间为16 h/d、光强2000～3000 Lx光照培养箱内培养。种子露白后苗龄10 d的无菌苗2片子叶可完全展开时从瓶中取出无菌苗，无菌条件下，将下胚轴切成 0.8～1.0 cm小段、子叶切成（3～5）mm×5 mm小块。将子叶正面向上放置，下胚轴横向放置，接种到诱导分化培养基上，相同光照培养箱条件下培养。每个品种、每种处理接种3个培养皿，每皿接种8～10个外植体，重复3次。2周继代1次，4周后统计结果，利用DPS软件进行数据分析。

1.3 培养基的优化

①诱导培养基优化 以MS为基本培养基，设置ZT、6-BA、IAA3种激素不同种类及不同浓度组合，共12个组合处理，详见表1。

②植株再生培养基优化 以MS为基本培养基，外源激素ZT设 0.2、0.5、0.8mg/L3个浓度处理。

③再生植株生根培养基优化 以1/2 MS为基本培养基，外源激素 NAA 设 0.10、0.30、0.5mg/L3个浓度处理。

所有处理培养基均附加有机成分Morel维生素 1000倍液 2mL/L、蔗糖 3%、琼脂 8.0%，pH值5.8，121℃温度下高压灭菌 15 min。

1.4 不定芽生长和生根统计

待愈伤组织生长出不定芽后，转移至植株再生培养基上，每种培养基接种5个三角瓶，每瓶接种6个外植体，重复3次，培养2周后统计不定芽生长情况。当不定芽长出2～4片真叶、长2～3 cm时，将其自基部切下并转接于生根培养基上培养。每种培养基接种10个三角瓶，每瓶接种2个再生苗，重复3次，培养4周后统计生根情况。

2 结果与分析

2.1 外植体愈伤诱导培养基的优化

由表2可知，不同配比的12种培养基对4个品种的子叶和下胚轴均能诱导出不定芽，但其诱导率存在显著差异。在不使用6-BA的培养基M1～M6中，ZT 2.0mg/L+IAA 0.2mg/L组合的M4培养基诱导产生不定芽的效果最好。为了研究比较6-BA与ZT对外植体不定芽诱导分化的效果，生长素IAA取最佳浓度 0.2mg/L，分裂素ZT、6-BA取不同浓度进行比较。当只加入6-BA时，M9培养基下胚轴的平均诱导率高于M7和M8培养基；当ZT和6-BA组合加入诱导培养基时，M10培养基的诱导效果最好，且诱导率明显高于M4和M9。

表1 愈伤诱导培养基的不同激素浓度组合

表2 不同生长调节物质组合诱导4种茄子品种不同外植体的不定芽诱导率 %

图1 4个品种的下胚轴（A）和子叶（B）外植体在M1～M12培养基上的诱导率

图2 下胚轴（A）和子叶（B）外植体在愈伤诱导培养基上的2周后的生长情况

由DPS软件进行数据统计分析可知，不同激素浓度组合的培养基显著地影响了茄子不定芽的诱导率，4个品种之间表现出相似的变化规律（图1）。2.0mg/L ZT 和3.0mg/L 6-BA 均能较好地诱导产生不定芽，0.2mg/L的IAA可以最佳地促进分裂素ZT和6-BA对不定芽的诱导分化。6-BA、ZT对外植体的诱导分化效果与茄子外植体类型和基因型都相关。对于不同外植体，ZT对子叶的诱导效果高于6-BA，最佳浓度为2.0mg/L；6-BA对下胚轴的诱导效果较好，最佳浓度为3.0mg/L。对于不同基因型，不定芽诱导的最适分裂素不同，6-BA对圆茄07675和长茄 03204的诱导效果高于 ZT，ZT对07683和03154诱导效果较好。IAA浓度为0.2mg/L，ZT 1.0～2.0mg/L+6-BA 1.0～2.0mg/L 组合使用时对4个品种的不定芽诱导效果均较好，据此推测，该水平下的ZT+6-BA+IAA组合可以比较广泛地适用于不同茄子品种的不定芽诱导分化。

2.2 外植体取材部位对植株再生的影响

横向放置在诱导培养基上的下胚轴，培养1周后形态学顶端向上翘起，2周后开始有丛生芽在翘起的顶端形成，不经过愈伤组织阶段，直接形成微型的小簇丛生芽结构，同时接触到培养基的下胚轴形态学下端形成愈伤组织（图2A）。在下胚轴形态学顶端没有形成丛生芽或丛生芽生长缓慢的情况下，下端愈伤组织也可分化产生不定芽。平铺在诱导培养基上的子叶，1周后体积明显膨大，伤口处开始产生愈伤组织，2周左右生长出不定芽生长点（图2B）。

表3 茄子愈伤组织诱导类型及其形态特征的比较

图3 愈伤组织类型分类

表4 不同外植体愈伤诱导类型和不定芽诱导率

试验中茄子的子叶和下胚轴的愈伤组织诱导率都在80%以上，子叶出愈率相对稍高。外植体诱导形成的愈伤组织大致可以分为C1、C2、C33种类型（表3）。C1型愈伤组织疏松，多呈透明淡黄色（图3A），分裂旺盛，较难诱导分化出不定芽；C2型愈伤组织较C1型紧密，多呈浅绿色（图3B），分化成不定芽系数较高；C3型愈伤组织紧实，多呈绿褐色（图3C），诱导分化产生少量不定芽。试验可观察到不同愈伤组织类型与不定芽的分化存在一定的制约关系，C2型最为理想，C1型和C3型愈伤组织产生不定芽的诱导率较低。但不同类型愈伤组织之间可以通过调节激素浓度在愈伤形成早期实现转换。若愈伤组织生长过于旺盛，则应降低生长素浓度，提高分裂素浓度；若愈伤组织生长缓慢，过于紧实，或色泽暗淡，趋于褐化，则要提高生长素浓度，减少分裂素浓度。同时还应注意保证培养基的养分充足，及时继代。

在各种诱导培养基中，子叶和下胚轴诱导出的主要愈伤组织类型不同，芽分化率也有显著差异（表4）。由子叶得到的大多为C2型愈伤组织，部分为C1型以及少量C3型愈伤组织；下胚轴诱导产生的愈伤组织大多为C3型。下胚轴的诱导率平均为59.0%，最高达79.3%；子叶的诱导率平均为29.8%，最高为53.9%。4个品种下胚轴外植体的诱导率都显著高于子叶，表明下胚轴外植体比子叶更容易诱导出芽，下胚轴分化能力高于子叶。

2.3 基因型对植株再生的影响分化能力影响的比较

4个品种的分化能力有明显差异，且在分化能力较低的子叶外植体上差异更为显著。圆茄07683最容易诱导分化出不定芽，其次是长茄03204和圆茄07675，长茄03154再生能力最差。4个品种不同外植体的最佳诱导培养基不同。就下胚轴来说，长茄03154和圆茄07675的最佳诱导培养基是M10，长茄03204和圆茄07683的为M11。从子叶来说，03154和07683的最佳诱导培养基是M11，03204和07675的为M10。

2.4 不同ZT浓度对不定芽生长的影响

下胚轴和子叶诱导出的不定芽在诱导培养基中生长缓慢，培养基中的IAA和高浓度的ZT或6-BA会抑制不定芽的生长，应及时转移至植株再生培养基中，下胚轴及子叶愈伤组织在植株再生分化培养基上2周后的生长情况见图4。由表5可知，下胚轴产生的不定芽在ZT浓度为0.5～0.8mg/L时，伸长率都为100%，但当ZT浓度为0.8mg/L时，不定芽畸形率较大。子叶产生的不定芽的畸形率随着ZT浓度的增加也在不断升高。当ZT浓度为0.5mg/L 时，伸长率最高，达 93.0%，且得到的有效再生苗数最多。本试验结果显示，最佳植株再生培养基为MS+ZT 0.5mg/L。

图4 下胚轴和子叶愈伤组织接种于植株再生分化培养基上2周后的生长情况

2.5 不同生根培养基对再生苗生根的影响

将再生苗接种在生根培养基上1周后切口处出现膨大，并形成少量的愈伤组织，2周左右出现不定根（图5A）。如表6所示，不加任何植物生长调节物质的1/2 MS培养基对茄子再生苗的生根效果较好，主根数最多（图5B），添加 0.1mg/L NAA 诱导不定芽生根效果最好，根系粗壮，更适合移栽（图5C）。随着NAA浓度的升高，基部开始产生较大的白色或淡黄色愈伤组织，有效生根减少。本试验结果表明，最佳生根培养基为1/2 MS+NAA 0.1mg/L。

3 结论与讨论

本试验研究了4个茄子品种的子叶和下胚轴组织培养和植株再生问题，建立了一套适于茄子遗传转化的优化组织培养与再生体系。试验结果表明，不同激素组合的培养基、不同外植体类型和不同茄子基因型均显著影响茄子不定芽的分化效果。2.0mg/L ZT和3.0mg/L 6-BA 能分别较好地诱导子叶和下胚轴产生不定芽，ZT 1.0～2.0mg/L+6-BA 1.0～2.0mg/L 组合比较广泛地适用于不同茄子品种的不定芽诱导分化，0.2mg/L的 IAA 可以最佳地促进分裂素ZT和6-BA对不定芽的诱导分化；茄子下胚轴的再生能力要显著高于子叶；不同茄子品种间的分化能力差异明显。最佳诱导培养基为MS+ZT 2.0mg/L+6-BA 1.0mg/L+IAA 0.2mg/L，下胚轴的诱导率可提高至79.3%，子叶的诱导率可提高至53.9%；最佳植株再生培养基为MS+ZT 0.5mg/L；最佳生根培养基为1/2 MS+NAA 0.1mg/L。

下胚轴形态学下端和子叶产生的愈伤组织诱导出的不定芽多为单生芽，但子叶产生的不定芽易出现玻璃化和畸形苗现象。下胚轴形态学顶端产生的成簇丛生芽一般只有1～2株能够生长发育成完整植株。利用下胚轴的极性现象，正向扦插比横向放置可以缩短顶端产生丛生芽的分化时间，这与黄志银等[16]的研究结果相似。下胚轴近根部片段比近子叶片段的形态发生潜能大，更易诱导分化出丛生芽。这与国外Matsuok等[4]、Sharma等[17]的研究结果相同，他们认为下胚轴的不同部位形态建成的潜能有明显不同，可产生的不定芽数目从高到低依次是基部、亚基部、亚顶端、顶端。然而余澜波等[10]得到相反的结果，他们认为下胚轴的上端比下端容易诱导出芽，且在极性上端易诱导出芽，下端易诱导出根，具体原因有待于进一步研究。

表5 不同ZT浓度对不定芽生长的影响

表6 不同培养基配方的生根效果比较

图5 再生苗的生根情况

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