巢式-PCR检测蜱体中土拉弗氏菌的fopA基因及血清学调查*

李志清 刘增加 上官改珍 何 莹巨 敏 李旭光 胡良煜 徐 燕

(1.解放军第323医院，西安 710054； 2.兰州军区疾病预防控制中心，兰州 730020)

土拉菌病又称“野兔热”，是由土拉弗氏菌Francisellatularensis经患病野生动物、吸血节肢动物或遭受污染的水或食物传播的一种自然疫源性疾病，呈世界性分布(Dennisetal., 2001; Tärnviketal., 2003)。土拉弗氏菌在自然界的宿主主要包括节肢类和哺乳类动物，如：蜱类、野兔类、鼠类等(Fulopetal., 1996)。在中国，土拉弗氏菌最早在1957年从黄鼠体内就分离得到。1959年黑龙江省报道了第一起人间感染野兔热(康成贵，1980)。随后证实西藏、新疆、甘肃等地存在土拉弗氏菌病的自然疫源地(郭从厚等，1981；孔昭敏等，1984；刘增加等，1995)。陕西省地处西北地区中部，与甘肃省毗邻，生态环境、自然资源与甘肃省十分相像，然而，陕西省并未开展此方面的研究，目前尚不清楚该病是否在陕西省存在。为此，2012年4月至2013年8月我们对陕西省部分地区土拉弗氏菌的自然感染作了调查研究，首先应用巢式PCR技术对蜱体内携带土拉弗氏菌进行检测，以了解陕西省蜱体中自然感染土拉弗氏菌的状况，同时收集调查地区人群的血清标本进行血清学检测，以明确人群血清土拉弗氏菌的抗体状况。此外，我们应用短串联重复序列(Short sequence tandem repeat, SSTR)多态性对检测阳性的标本进行基因分型，结合流行病学资料研究基因型与地理分布、媒介蜱种等方面的关系，为陕西省土拉弗氏菌病的分子流行病学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病原分子生物学检测

1.1.1标本采集：调查地点：陕西省调查点包括富县、陇县，属于子午岭山区。蜱标本的采集：采用布旗法收集游离蜱标本，分类鉴定后保存待用。血标本的采集：采集当地居民血液标本，在知情同意的情况下，从被调查对象肘静脉处采静脉血5 mL，静置或离心分离出血清后置4℃冰箱待检。

1.1.2病原体DNA的提取: 蜱标本中病原体DNA的提取，将已定种的单只蜱标本，用75%酒精浸泡20 min，用无菌滤纸吸干，用生理盐水漂洗3次，用无菌滤纸吸干蜱体表水份，置EP管中，加入DNA提取缓冲液 (10 mmol/L Tris, pH 8.0, 2 mmol/L EDTA, 0.1% SDS, 500 μg of proteinase K/mL) 200 μL，用灭菌的枪头进行充分研磨，置56 ℃孵育2 h，置100 ℃水中煮10 min，移至4 ℃离心机中,5 000 r/ min 离心5 min,上清液于- 20 ℃保存备用。

1.1.3PCR扩增: 标本使用4对引物检测(表1)，其中FNA8L/FNA2L及FNA7L/FNA1L为两对巢式PCR引物，扩增土拉弗菌的fopA基因(Fulopetal., 1996)；C6/C8引物为种特异性引物，通过扩增片段的长度不同来区分土拉弗菌A、B两亚种。对fopA基因扩增阳性的标本采用9F/9R引物扩增土拉弗氏菌基因中的SSTR9区进行基因型扩增。所用引物由TaKaRa公司合成。所有扩增均在ABI2700 PCR仪上进行。

表 检测用引物序列及PCR反应条件Tab.1 Primers and PCR condition used in the study

* A亚种扩增片段长度为250 bp，B亚种为220 bp。

1.2 血清学检测

在采样地点收集当地居民的血清标本，进行血清学检测。利用胶体金试纸条(军事医学科学院微生物流行病研究所研制)检测人群血清中土拉弗氏菌IgG抗体。

1.3 统计分析

应用χ2检验比较不同地区、不同媒介感染率的差异性，统计处理应用SPSS (9.0)软件。

2 结果

2.1 蜱中土拉弗氏菌的检测

陕西省富县、陇县共采集3个蜱种：达吉斯坦革蜱Dermacentorqinghaiensis、日本血蜱Haemaphysalisjaponica、嗜群血蜱H.concinna，共1 116只蜱标本。共有3个蜱种25只蜱标本检测阳性(扩增出400 bp左右片段，图1)，总阳性率为2.24%。不同蜱种阳性率有差别(χ2=20.91，P=0.00)，其中以日本血蜱的阳性率最高，达到15.39%(表2)。

2.2 土拉弗氏菌亚种鉴定

采用亚种特异性引物(C6/C8)对扩增阳性的标本进行土拉弗氏菌的亚种鉴定，所有阳性标

图1 蜱标本中土拉弗氏菌扩增阳性结果Fig. 1 The result of positive samples 1: 阴性对照；2～4，9～13：检测阴性标本； 5,7,8：检测阳性标本，6：100 bp ladder Marker。 1: Negative control; 2-4,9-13: Negative sample; 5,7,8: Positive samples; 6: 100 bp ladder Marker.

表2 陕西省富县、陇县不同蜱种土拉弗氏菌感染检测结果弗氏菌感染检测结果Tab.2 Prevalence of F. tularensis in ticks

本扩增出220 bp条带。25份标本中选取10份，其中达吉斯坦革蜱3份，日本血蜱2份、嗜群血蜱5份，进行序列测序，获得核酸序列，经在检索，与GenBank数据库中土拉弗氏菌holarctica 亚种参考菌株序列AF247690.2 100%同源。

2.3 阳性标本SSTR9位点的分析

SSTR9区域是一9 bp(AAAACAAAGAC、AATAAGGAT及AATAAAGAC三种组合方式)的重复单元，有不同的序列组合，但此位点虽然存在不同的序列组合，但其并不影响氨基酸的排列。对25份阳性标本进行扩增，其中5份标本未扩增出目的片段，20份标本扩增出目的片段。SSTR9区共有6种不同的拷贝数分别为7，8，9， 16，18及21(图2)。这表明此位点存在6种不同的基因型，6种基因型中以拷贝数为9的占多数(40.00%)。

图2 SSTR9区扩增结果Fig. 2 The results of SSTR9 region 1：阴性对照；2：50 bp Marker; 3-8:不同基因型 1: Negative; 2: 50 bp Marker: 3-8: Different genotype.

2.4 基于SSTR9区序列阳性标本聚类分析

基于阳性标本的SSTR9区序列， 利用Plylip3. 63 软件包中SEQBOOT 分析，重复数为1 000；然后采用Jukes-cantor 距离模式，选用Neighbor-Joining(NJ)建树方法，依次运用DNADIST、NEIGHBOR 和CON-SENSE 程序得到系统发生树。20份标本主要分为两大群(图3)。

图3 基于SSTR9区的聚类分析Fig.3 The cluster analysis based on SSTR9 region

2.5 血清学检测

陕西省富县、陇县土拉弗氏菌病血清流行病学调查共采集到当地居民血清标本725份，检测土拉弗氏菌病血清IgG抗体，阳性者37份，阳性率为5.10%(表3)。

表3 不同地区人群土拉弗氏菌病血清学检测结果Tab.3 The seroprevelence of tularemia from different regions

3 讨论

土拉弗氏菌传染力、致病力强，易于传播，美国等许多西方国家已将其与炭疽、鼠疫、天花等一起列入A类生物恐怖病原，而我国一直未引起足够重视。本研究首次在陕西省子午岭山区从蜱中检测到土拉弗氏菌DNA片段，并发现当地人群中亦有感染者，这些证据在一定程度上说明陕西省可能存在土拉弗氏菌的自然疫源地，目前迫切需要从病原学、媒介、宿主动物等多方面进行详尽的流行病学调查，以阐明该病在陕西的分布及流行病学特征；对疫源地应进行长期监测，了解其变化情况，并采取积极的措施防患于未燃。

相关研究显示土拉弗氏菌主要分布在北纬30°以北的广大地区(Dennisetal., 2001)，我国许多省区都位于该范围之内，其中包括陕西省。本研究共调查检测了4个蜱种1 117只蜱标本，总阳性率为2.24%，其中以日本血蜱的阳性率为最高，达到15.39%，不可否认的是此数据可能存在偏移，因其采集的数量有限，同时目前尚不能确定日本血蜱为其媒介，相关的传播动力学实验尚未开展，今后应扩大此蜱种的样本量，并从传播动力学方面开展相关研究以阐明上述问题。

研究共采集到当地居民血清标本725份，共有37份标本显示为阳性，总阳性率为5.10%，这说明当地居民中存在自然感染的情况，这在一定程度上更加说明了该病在陕西省的存在，一直没有病例报告，究其原因可能一方面大多数人并不了解该病，其症状不典型而被误诊或漏诊；另一方面，该病治疗简单，对普通抗生素有效而未上报。事实上，该病在陕西省的存在并不奇怪，陕西省与甘肃省邻近，两地区的自然环境亦非常相似，而后者早就有该病的报道，今后应系统地开展土拉弗氏菌病的相关研究。

土拉弗氏菌包括4个亚种, 各亚种在地理分布、宿主动物、毒力及传播途径等流行病学特征方面差异较大。其中土拉弗氏菌土拉亚种即A亚种和土拉弗氏菌全北区即B亚种是主要的分离株,人间土拉菌病的爆发大多数与这两个亚种有关。A亚种为高毒亚种，10个菌体即可引起人或动物(如家兔)致病，几乎严格分布于北美。B亚种毒力较A亚种弱，家兔对其敏感性较小，一般达109～1 010个/mL方可引起家兔死亡，B亚种主要分布在欧洲和亚洲,也见于北美部分地区。中国目前所有分离株经生化、毒力检测等均判定为B亚种。虽然土拉弗菌主要有2个亚种，但亚种内变异和差别较大，当疾病发生时病原体的快速溯源尤为重要，此时快速高效的分析方法往往起到事半功倍的效果。短串联重复序列是DNA复制过程中链滑动的结果，在原核和真核生物中广泛存在，以该序列多态性为基础的分型方法已被成功地应用于多种病原体的分型。Johanson等(2004)已成功地将此法应用于土拉弗氏菌，取得了较好的效果。本研究中利用该方法，选取最常用的两个基因区，对检测阳性的标本进行基因型别分析。研究结果显示尽管检测到的土拉弗氏菌均为B亚种，但存在6种不同的基因型别，这也说明陕西省土拉弗氏菌基因型别的多样性。聚类分析结果显示出了阳性标本基因型别与地域分布有一定的关联的特点，这可能与蜱种的地区分布特点有关，这与Goethert(2004)的研究结果一致。由于本研究中阳性标本数量有限，目前的研究结果尚达不到根据地区准确划分基因型的要求，今后扩大采样，扩大阳性标本的数量，甚至分离病原体可能利于该问题的阐明。但本研究的结果提示了我国西北地区的土拉弗氏菌基因型别的复杂性和系统地开展相关研究的必要性。