甘肃南部部分地区Q热分子流行病学调查研究*

罗 芳 张 芳 刘增加(兰州军区疾病预防控制中心， 兰州 730020)

Q热是由贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetii，C.b俗称Q热立克次体)引起的一种自然疫源性疾病。已报道的Q热疫区遍及全球各大洲几乎所有国家，成为当前分布最广的人畜共患病之一。人类和动物对其普遍易感，可通过气溶胶广泛传播，一旦流行将难以控制，因此美国反恐怖组织将其列为生物战剂之一(Azadetal., 2003, 张丽娟，2007)。贝氏柯克斯体可引起人类急、慢性Q 热，临床表现无特异性，60% 无任何症状( Karakousisetal.，2006) ,急性Q 热常表现为发热、头痛、肌肉酸痛，常伴有肺炎、肝炎等。因缺乏典型的临床表现，因而常常被误诊为“流行性感冒”、“肺炎”、“沙门氏菌感染”、“布鲁氏菌感染”和“传染性肝炎”等，误诊率达100%(俞树荣，2000)。

由于Q热在我国并不是法定报告传染病，因此对其缺乏认识、实验室检测能力不足，受感染后的病症与其他疾病病症的相似性，我国Q热病例几乎都是回顾性诊断，误诊和漏诊的情况相当严重(Karakousisetal., 2006; Zhangetal., 2006; 程仕虎等，2007；朱晓宇等，2008)。为了解甘肃省Q热感染情况，我们在甘肃南部部分地区从媒介动物及当地人群两个方面展开调查，以期明确该病在西北地区的分布及分析人群感染的潜在危险因素。

1 材料与方法

1.1 采集地点

调查点为甘肃省岷山北麓地区，采样时间为2009年4～6月及2013年5月。

1.2 标本的采集

蜱标本：采用布旗法，分类鉴定后保存待用。人群血标本：当地居民在知情同意的情况下，按项目预先设计的调查表登记被调查对象的相关资料。资料包括性别、年龄、职业等；相关的危险因素主要为：(1) 家中是否饲养牛羊； (2)家中牛羊是否有不明原因的流产；(3)牛羊生产过程中是否自己接生；(4)接生过程中是否采取保护措施(如戴口罩等)。在调查登记中上述相关危险因素中如满足第1条则继续后2～4条的填写，如不满足，则终止。填写相关调查表后，从被调查对象肘静脉处采静脉血3 mL，静置或离心分离出血清后置4 ℃冰箱待检，家畜(牛、羊)血标本：静脉血5 mL，静置或离心分离出血清后置4 ℃冰箱待检。鼠标本：鼠标本采用夹夜法，诱捕不同生境下的野栖鼠。所获标本经鼠种鉴定后现场无菌解剖，取组织置-20℃保存待用。

1.3 细菌DNA的提取

鼠标本中病原体DNA的提取：经鼠种鉴定后，无菌操作剪取约3 mm3(约500 mg)大小的脾组织，置灭菌研磨器中加入Trizol，充分研磨后移入Eppendorf管中；通过离心分离去除RNA后，通过2次洗涤(0.1 mol/L 柠檬酸钠10%乙醇溶液)后获得DNA沉淀，然后将其悬于75%酒精中静置10～20 min。2～8℃, 2 000×g离心5 min, 然后将DNA沉淀溶于8 mmol/L NaOH溶液中，4℃过夜。最后将提取好的DNA溶于TE (0.01 mol/L, pH 8.0) 中，紫外分光光度计测量DNA浓度及纯度后置-20℃备用。

蜱标本中病原体DNA的提取：经蜱种鉴定后，用75%酒精浸泡20 min 后，用无菌滤纸吸干，再用生理盐水，漂洗3 次，用无菌滤纸吸干蜱体表水份后，置EP管中，加入 DNA提取缓冲液 (10 mmol/L Tris, pH 8.0, 2 mmol/L EDTA, 0.1% SDS, 500 μg of proteinase K/mL) 50～200 μL, 用灭菌的枪头进行充分研磨, 后56℃孵育2 h, 置沸水中煮10 min 后置-20 ℃保存备用。

1.4 病原体的检测

针对C.b的23S rRNA 基因序列，采用巢式PCR法扩增(陈荣等，2001)第1对引物为C.b23S IVSF/R，第2对引物为Cb IVSF/R，Cb 23S IVSF：5′-CTTTAAAGAAAGCCTAATAG-3′， Cb 23S IVSR: 5′-TTACTTTATGTCAGCATTCG-3′，Cb IVSF: 5′-TCACTGGTCGAGTCGTC-3′Cb IVSR: 5′-ATTCGCACTTCTGATACC-3′。反应条件：两轮扩增条件一样。扩增条件：94℃ 3 min；94 ℃ 60 s, 55℃ 60 s, 72℃ 60 s, 30个循环, 最后72 ℃ 5 min。第2轮扩增：取第1轮产物2 μL 为模板，反应体系和条件同第一轮。最终目的片段大小为600 bp左右。

1.5 血清学检测方法

间接免疫荧光法检测(Setiyonoetal., 2005)：采用军事医学科学院微生物流行病研究所制备的抗原片，过程简述如下：将血清用PBS (0.01 mol/L pH 7.4)从1：16 开始倍比稀释，取稀释好的血清滴加于抗原片孔中，37 ℃孵育45 min，取出用PBS (0.01 mol/L, pH 7.4)及蒸馏水冲洗晾干，检测人群血清时点上FITC标记的抗人Ig G抗体，检测牛血清时点FITC标记的抗牛Ig G抗体，检测羊血清时点FITC标记的抗羊Ig G抗体，37 ℃孵育45 min，冲洗晾干后，置荧光显微镜下观察，血清效价为≥1：80者可判为血清抗体阳性。

1.6 统计分析

应用χ2检验比较不同地区、不同职业阳性率的差异；相关危险因素分析,采用非条件logistic 回归计算各危险因素与血清阳性发生的联系强度,用比值比(odds ratio, OR)表示，统计处理应用SPSS (10.0)软件。

2 结果

2.1 蜱中Q热立克次体感染情况

森林革蜱Dermacentorsilvarum、草原革蜱D.nuttalli、达吉克斯坦硬蜱D.daghestanicus及日本血蜱Haemaphysalisjaponica4个蜱种1 273只蜱标本，其中若蜱1 126只，均为日本血蜱；成蜱147只，其中森林革蜱56只，日本血蜱10只，草原革蜱56只，达吉斯坦硬蜱25只。将若蜱按不同种类每20只左右为一组进行处理和检测，共分为67组，有5组检测到Q热DNA片段(图1)。147只成蜱中7只森林革蜱、7只草原革蜱、及3只日本血蜱检测阳性，成蜱总阳性率为11.56%。

图 1 蜱标本中病原体扩增结果Fig.1 The PCR results from tick samples M： 分子量标准； 1：阴性对照； 2～4：阳性标本。 M: 100bp ladder Marker; 1: Negative control; 2-4: Postive sample.

2.2 当地居民感染情况

共采集当地居民血清标本446份，受检对象年龄在15～75岁之间，其中男性229例，女性217例，职业主要包括职工、农民、牧民等，各家饲养家畜(猪、牛、羊)及家禽(鸡)较普遍。牧民家主要饲养牛、羊。此次共检测到阳性标本29份，总阳性率为6.50%，不同职业阳性率存在差异(χ2=37.64,P=0.00),以牧民的阳性率为最高，达到25.42%(表1)。

2.3 家畜感染情况

共采集家畜血液标本326份，其中牛56份，检测阳性5份，羊270份，阳性29份，二者未见明显差别。

2.4 野栖鼠感染情况

共捕获大林姬鼠Apodemuspeninsulae(12只)、黑线姬鼠A.agrarius(11只)、小林姬鼠A.sylvaticus(10只)及灰仓鼠Cricetulusmigratorius(9只)4个鼠种42只野鼠，其中大林姬鼠2只，灰仓鼠1只，共计3只检测阳性。

表 1 不同人群血清检测结果Tab.1 Results of IFA from different occupation

2.5 相关危险因素分析

对相关因素进行单因素分析，发现家中是否饲养牛羊、牛羊是否有不明原因流产、接生是时是否采取保护措施，上述3个因素与血清阳率有关，其中前两个因素为危险因素，而接生时是否采取保护措施为保护因素(表2)。

表2 血清阳性相关因素的单因素分析结果Tab.2 Association analyses of seropositive with risk factors

3 讨论

自1937年Q热(“Q”是Query的第1个字母，意为疑问)在澳大利亚被首次发现以来(Bacaetal.，1983)目前已报道的Q热疫区几乎遍及全球各大洲所有的国家，Q热已经成为当前分布最广的人兽共患病之一。在我国经血清流行病学调查和病例证实，Q热分布遍及北京、河北、内蒙古、黑龙江、吉林、辽宁、四川、重庆、云南、广东、广西、海南、山东、江苏、安徽、福建、甘肃、新疆及西藏等二十余省市自治区，其中内蒙、四川、新疆、云南及西藏等地区还发生过Q热的暴发流行(俞树荣, 2000)。本研究在甘肃南部农牧业区选点，从媒介、宿主及人群进行系统的流行病学调查研究，证实了该病在调查点的存在；同时通过病例对照研究发现了存在的相关危险因素，为该疾病的有效预防提供了数据支持。

Q 热在我国不属于法定报告传染病，目前，我国仍缺乏详实的 Q 热全国流行病学调查资料。而其病原体具有毒力强，一个菌即可使人感染的特点，因此被列入重要的生物战剂而备受关注。Q热又是一种重要的自然疫源性疾病，其在自然界中的宿主种类广泛，包括野生及家养的哺乳动物、鸟类及多种节肢动物。而在动物间的传播媒介主要为蜱，且可以经卵传播，保证了自然疫源地长期存在。牛、羊、家畜、鸟、野生啮齿动物以及蜱是该病原体的主要储存宿主( Eklundetal.,1947; Buhariwallaetal., 1996; Brouquietal., 1997)。本研究从媒介、宿主及人群3个方面系统地进行调查研究，在所调查的4个蜱种中有3个蜱种检测到Q热立克次体DNA片段，值得注意的是本研究首次从若蜱中检测到病原体DNA片段，这有可能是若蜱机械携带，但亦有可能提示病原体可以经期传播，这需要在今后的工作中进一步进行验证。野生啮齿动物亦是Q热立克次体的主要储存宿主，在我国目前证明了野生小哺乳动物中的喜马拉雅旱獭、藏鼠兔、达乌利亚黄鼠、黄胸鼠有感染，本研究从捕获的黑线姬鼠及大林姬鼠体内检测到病原体DNA，但其在Q热疫源地中保持和传播病原体方面所起的作用，有待进一步研究。

人类感染的主要途径是气溶胶感染 (Maurinetal.,1999)，其次是消化道，易于接触感染动物的人群如农民、畜牧业工作者、实验室人员、肉类加工者等。人感染Q热后常表现为发热、头痛、肌肉酸痛，因缺乏典型的临床表现，临床上多误诊为“流行性感冒”等等，而动物感染Q热后多呈亚临床经过，动物有时出现食欲不振，体重下降，产奶量减少和流产、死胎等现象，由此可以看出该病具有很大的隐匿性，不容易被人们所认识，本研究中在对当地居民的血清学调查中发现，其阳性率为6.58%，说明当地居民中有感染者，尤其是牧民，其血清阳性率最高，达到25.26%，其原因可能其暴露机会高。在同时开展的相关危险因素中调查发现：家中是否饲养牛羊、牛羊是否有不明原因流产是人群血清阳性发生的危险因素，家中饲养的家畜越多，家庭成员接触的机会也越多，其感染的机会也就越高；同时家畜不明原因流产有可能就是感染了Q热而造成的，这样亦使接触者感染的机会增加。事实上已有研究阐明：Q热有因孕兽分娩、屠宰旺季等因素而呈现季节性上升或暴发的现象，亦有研究从动物的胎盘中分离获得了Q热病原体，本研究中的相关因素分析中发现：接生时是否采取保护措施为Q热血清阳性的保护性因素，因此在动物生产过程中，采取适当的保护措施将有利于预防疾病的发生。

Q热虽然病死率低，但其病原体的感染力和在外环境中的抵抗力都很强，极易传播；而且牛、羊等家畜感染及畜产品的污染又会导致卫生学方面的问题。目前我国可能仍有许多急性和慢性Q热病人未得到正确诊断和及时治疗，如不加以重视，一旦疫情蔓延，有可能影响社会稳定和造成经济损失。