DNA条形码技术在黑瞎子岛鼠类鉴定中的应用*

刘润吉 张荣波 李 明 刘丽娟 呼满霞 王 静 曹晓梅 郭天宇 张晓龙**

(1.安徽理工大学,安徽淮南 232000；2.中国检验检疫科学研究院,北京 100123；3.黑龙江出入境检验检疫局，哈尔滨 150001)

传统形态分类方法用于日常物种鉴定，会出现表型可塑性和遗传变异性引起的鉴定错误、忽略隐存种、受限于个体发育阶段和性别等4个明显的局限性(Hebertetal.,2003)。传统形态学分类的固有局限性、地球上多达1000万的庞大物种数量和不断缩减的分类学家队伍，预示着对一种新的分类方案的巨大需求。20世纪后半叶，遗传物质核酸登上了自然科学史的舞台，人们对基因的认识和操作水平突飞猛进，系统分类学开始了以基因或基因产物解析物种演化历史的新历程。DNA测序和PCR问世后，对基因进化速率的研究也几乎同时展开(Zinneretal.,2009; 刘海龙，2009; Wangetal.,2011)。由于线粒体没有内含子，较少受到重组影响，且为单倍型遗传模式，所以比细胞核基因更适合用作分类标准。线粒体12S和16S核糖体基因存在大量的插入和缺失现象，使序列比对陷入困境，制约了它们在分类中的应用。线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ基因(COⅠ)比其他线粒体基因拥有更多的系统发育信号，COⅠ基因密码子的第3位核苷酸表现出很高的碱基置换率，这使得COⅠ基因在分子进化速率方面超出12S rDNA和16S rDNA两倍之多(Hebertetal.,2003)。COⅠ基因的氨基酸序列变化率要比cytb和任何其他线粒体基因更慢一些，这使得COⅠ基因能够提供更广阔的有关系统发生的视角。2003年，加拿大生物学家Hebert在总结前人工作的基础上，以加拿大37种蚊虫、北美260种鱼类、南美531种热带蝴蝶和87种蝙蝠为研究对象，提出以COⅠ基因为主要标准基因的DNA条形码技术。 (Hebertetal.,2003; Lecompteetal.,2008; Pereiraetal.,2010)。

目前DNA条形码研究的重点是界定种内种间遗传差异和物种之间的变异范围。在分析种内种间差异阈值时，往往出现样本量太少的情况，以致不能做出有效的统计分析，无法进行精确评估(陈春生等，2012；马英等，2012)。

鼠类是多种自然疫源性疾病的储存宿主。快速准确地鉴别鼠类，是防控疾病的关键。针对鼠类的传统形态学鉴定十分依赖于对鼠类的头骨、牙齿和外形的辨别，具有很强的专业性。本研究通过DNA条形码技术，对黑瞎子岛地区常见的2科3属4种41只鼠类的序列进行种内种间遗传距离的计算和聚类分析，以便积累鼠类条形码数据，建立COⅠ基因条形码数据库。

1 材料与方法

1.1 标本采集

所用实验样品为2011年在黑瞎子岛地区采集的鼠类，形态学鉴定为：棕背Clethrionomysrufocanus5只，红背C.rutilus8只，东方田鼠Microtusfortis28只，花鼠Eutamiassibiricus3只。现场鉴定后，分离肝脏和脾脏组织，保存于-80℃。从GenBank和BOLD systems下载用于分析的其他条形码序列，详见表1。

表1 实验样本信息Tab.1 Information of samples in this research

1.2 基因组DNA提取

取鼠肝脏或脾脏组织20 mg，研磨均匀。用北京天根生物公司基因组DNA提取试剂盒，提取组织DNA，并保存于-20℃。

1.3 PCR反应和序列测定

COⅠ基因扩增所使用的通用引物为COⅠ-L(5′-ACTTCTGGGTGTCCAAAGAATCA-3′)和COⅠ-H(5′-CCTACTCRGCCATTTTACCTATG-3′)(Robinsetal.,2007)。在50 μL反应体系中，Premix Taq(Takara)25 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，模板3 μL，去离子水20 μL。 PCR反应参数为：94℃预变性5 min; 94℃变性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10 min。随后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并送北京华大基因测序。

1.4 COⅠ序列分析和系统树构建

用Chromos软件查看COⅠ基因序列峰图，判断峰图质量。用Clustal X软件进行多重序列比对。校正后的COⅠ序列在NCBI上用BLAST程序进行同源性比对。用MEGA5.0软件计算COⅠ序列的碱基组成。基于Kimura-2-parameter模型计算种内和种间遗传距离，以邻接法(Neighbour-joining,NJ)构建系统进化树。最大简约法分析使用启发式搜索，参数如下：1 000 逐步加入法随机加入序列构树方法采用二等分再连接(Tree-bisection reconnection,TBR)，可靠性由1 000次自展分支检验。邻接法分析采用HKY85遗传距离，自展检验1 000次。

2 结果

2.1 41个鼠类标本COⅠ基因扩增结果

通过通用引物成功扩增出41个鼠类标本的COⅠ基因片段，大小约为750 bp。电泳结果未发现非特异性杂带。通过测序，进一步验证了扩增结果。

2.2 COⅠ基因的BLAST比对结果

将41个鼠类样本COⅠ基因序列同NCBI上鼠类条形码序列进行同源性比对，结果显示，5只红背被误判为棕背，24只莫氏田鼠被误判为东方田鼠，1只大林姬鼠被误判为东方田鼠。其余样本形态学鉴定结果和DNA条形码比对结果一致。

2.3 种内与种间遗传距离

用MEGA5.0软件，基于Kimura-2-parameter模型计算黑瞎子岛地区41个鼠类标本的平均种内和种间遗传距离，见表2。

表2 黑瞎子岛地区鼠类两两比对的种间平均遗传距离和种内遗传距离Tab.2 Average intraspecific genetic distance and average interspecific genetic distance

注：棕背样本数据来自BOLD systems数据库
Note: TheC.rufocanussample date comes from BOLD systems

2.4 系统发育树构建

邻接法构建的系统发育树可以反映序列之间的真实距离。本研究利用黑瞎子岛地区4种鼠类共41个COⅠ基因序列，连同BOLD systems和GenBank中的鼠类序列，用NJ法构建系统发育树，结果如图1。聚类分析结果表明，黑瞎子岛地区常见4种鼠类的同种个体聚为单独的一支，同属不同种的个体聚为更大的一支，同科不同属的分支聚为一总支。

图1 NJ法构建的黑瞎子岛地区常见鼠类分子系统树Fig.1 NJ tree based on COⅠ gene fragments from 41 individuals of 4 rat species

3 讨论

黑瞎子岛地区41个鼠类样本COⅠ基因序列在NCBI数据库进行BLAST比对后，结果显示，相似性在99%～100%。在对鼠类样本进行PCR扩增时，花鼠样本未能出现特异性条带，推测原因可能是扩增体系不完全合适，以后研究中将加以改善。

基于COⅠ基因DNA条形码技术的检验标准之一是种间差异远大于种内差异。Hebert等(2003)对GenBank中13 320个亲缘关系很近的同属物种的COⅠ序列进行了分析，结果表明种内差异大多小于1%，极少大于2%，而种间差异则高达11.3%。本研究中通过对黑瞎子岛地区2科3属4种41个鼠类个体COⅠ基因序列进行分析，同一种鼠类不同个体的DNA条形码序列差异很小，为0.003～0.008，平均为0.005；种间差异则很大，为0.108～0.346，平均为0.258。平均种间遗传距离是种内遗传距离的51倍，完全符合Hebert所作出的关于DNA条形码有效性的检验标准。

DNA条形码技术鉴定物种时，种间遗传距离和种内遗传距离之间的分离程度十分重要，有效的鉴定意味着种间遗传距离和种内遗传距离没有重叠(Aliabadianetal.,2009)。本研究对黑瞎子岛地区常见的4种41个鼠类标本的条形码序列进行了分析，结果表明4种鼠类的种内遗传距离和种间遗传距离没有重叠区域，这些数据提示DNA条形码为有效区分鼠类提供了可能的手段。

构建系统发育树进行分子鉴定是非常直观的方法。NJP法构建的系统发育树聚类分析结果表明，不同种类的鼠位于不同的分支，不同种属的鼠类区别明显。每一个单系分支对应一个特异的物种，节点支持率为100%。在分支长度上，种间分支较长，种内分支则很短。本研究以实验所得的41个COⅠ序列和从NCBI和BOLD systems中得到的14个相关鼠类COⅠ序列构建系统发育树，每种鼠类形成的独立分支进一步验证了DNA条形码鉴定鼠类的有效性。

本研究以黑瞎子岛地区41个鼠类个体为样本，扩增COⅠ基因，结合Genbank和BOLD systems中相关的鼠类COⅠ序列，计算种内种间遗传距离，并进行序列聚类和系统发育分析，证明基于COⅠ基因的DNA条形码技术不仅能够方便、快捷、准确的鉴定鼠类，纠正形态学鉴定中的失误，而且还能很好的鉴别形态相近的近缘种。DNA条形码技术必将在口岸检验检疫、保护农业生产安全、保护生态安全方面发挥重大的作用。