rDNA-ITS2序列作为中国按蚊分子鉴别特征的评述：Ⅱ塞蚊亚属*

伍 桐 诸德源 王一然 马雅军

(1.第二军医大学热带医学与公共卫生学系热带传染病教研室，上海 200433；2.第二军医大学学员旅学员一队，上海 200433)

关于rDNA-ITS2序列作为中国按蚊分子鉴别特征的评述，笔者分为两个部分(按蚊亚属和塞蚊亚属)进行，本文评述的是第Ⅱ部分，即塞蚊亚属蚊种。塞蚊亚属(SubgenusCellia)隶属于双翅目(Diptera)，蚊科(Culicidae)，按蚊亚科(Anophelinae)，按蚊属Anopheles，中国已记录30余种(陆宝麟，1997； Harbach，2007；2012)。

1 材料与方法

1.1 rDNA-ITS2序列信息

在GenBank数据库中，以中国塞蚊亚属蚊种名为关键词(陆宝麟等，1997)，搜索获得其所有注册登记的ITS2序列，进行整理。

1.2 序列分析方法

将下载的所有序列，首先采用Clustal X软件包进行对齐和比对分析，之后转化为MEGA5可识别文件，计算序列间的差异性(p-distance)。

2 结果

2.1 ITS2序列信息

截至2013年7月，GenBank中公布的中国塞蚊亚属蚊种的ITS2序列共442条，隶属27种(表1)。

2.2 ITS2序列在种内的差异

2.2.1库态按蚊: 已注册ITS2序列的库态按蚊样本来自印度、伊朗、柬埔寨和中国，其样本信息或描述为A、B、C、D和E种，或未描述，各种是依据唾腺多线染色体和雄蚊的染色体核型确定(Singhetal.,2004)，共33条。比对所有的序列，EF192274与其他序列间差异性大于10%；库态按蚊A与D种间序列差异性小于0.3%，无种信息的AY427755、JF966734和JF966735应为A/D；库态按蚊B、C与E种间差异小于1%，AY427754应为B/C/E，笔者注册的我国库态按蚊样本应为B种(马雅军等，2011)；A/D与B/C/E之间的差异范围为4.9%～6.2%。

表1 中国塞蚊亚属蚊种在GenBank中的rDNA-ITS2序列信息(截至2013年7月)Tab.1 Nucleotide sequences of the rDNA-ITS2 of Chinese Subgenus Cellia mosquitoes in the GenBank (by July 2013)

续表1
Tabl.1Continued

种类Species测序样本信息Sequence featureGenBank登记号Accession number文献References达罗毗按蚊An.dravidicus泰国Thailand Form KDQ518624Walton et al., 2007老挝LaosDQ002906直接提交Direct submission中国ChinaAF261951Ma et al., 2006; 马雅军等, 2011印度IndiaJQ446414-16Singh et al., 2012泰国ThailandFJ526587-88Morgan et al., 2009溪流按蚊An.fluviatilis伊朗IranDQ662405/AF440788/AY049001直接提交Direct submission伊朗IranAY172564-67Naddaf et al., 2003伊朗IranDQ238491Chen et al., 2006—AY427767直接提交Direct submission伊朗Iran Type SDQ344524直接提交Direct submission印度India Type SDQ345964Singh et al., 2006伊朗Iran Type UGQ926569-89/DQ344525直接提交Direct submission伊朗Iran Type UDQ238492Chen et al., 2006伊朗Iran Type VDQ344526/AF333384直接提交Direct submission伊朗Iran Type TDQ427095直接提交Direct submission伊朗Iran Haplotype TGQ857439-49Mehravaran et al., 2011伊朗Iran Type T1GQ926590-91直接提交Direct submission伊朗Iran Type T1DQ238490Chen et al., 2006伊朗Iran Type T2AF440788/AY049001/AY049005直接提交Direct submission印度India Type XAF167298Manonmani et al., 2001印度India Type YAF167299/AF509342Manonmani et al., 2001伊朗Iran Type YAF509343-53/AY172564-66Naddsf et al., 2003伊朗Iran Type YAY172567/AY049003/AY365048/AY365051直接提交Direct submission哈里森按蚊An.harrisoni2泰国ThailandAF194506Sharpe et al., 2000缅甸MyanmarDQ665847Singh et al., 2006越南VietnamAY255109Garros et al., 2005—AF230462Van Bortel et al., 2000中国ChinaAF416784周水森等, 2002中国ChinaDQ238493Chen et al., 2006中国ChinaAY007167Ma et al., 2005; 马雅军等, 2011无定按蚊An. indefinitus菲律宾PhilippinesGQ870332直接提交Direct submission詹氏按蚊An.jamesii印度IndiaJN710012Zomuanpuii et al., 2013斯里兰卡Sri LankaFJ526628-29Morgan et al., 2009缅甸MyanmarFJ526630Morgan et al., 2009泰国ThailandFJ526631Morgan et al., 2009杰普尔按蚊An.jeyporiensis印度IndiaJN643728Zomuanpuii et al., 2013—AF230466Van Bortel et al., 2000卡瓦尔按蚊An. karwari斯里兰卡Sri LankaFJ526635Morgan et al., 2009腹簇按蚊An.kochi中国ChinaEU650424马雅军等, 2011多斑按蚊An.maculatus印度IndiaJQ446428-38Singh et al., 2012印度IndiaJN710013Zomuanpuii et al., 2013—EF192272直接提交Direct submission泰国Thailand Form KDQ518615Walton et al., 2007越南Vietnam Form KDQ518617Walton et al., 2007柬埔寨Cambodia Form KDQ518618Walton et al., 2007马来西亚Malaysia Form KDQ518619Walton et al., 2007中国China Form KDQ518616Walton et al., 2007越南VietnamAY803346-52直接提交Direct submission

续表1
Tab.1Continued

种类Species测序样本信息Sequence featureGenBank登记号Accession number文献References—AF440197直接提交Direct submission中国ChinaAF261950Ma et al., 2006; 马雅军等, 2011缅甸MyanmarFJ526577-78Morgan et al., 2009斯里兰卡Sri LankaFJ526579Morgan et al., 2009柬埔寨CambodiaFJ526580-81Morgan et al., 2009泰国ThailandFJ526582-83Morgan et al., 2009老挝LaosFJ526584Morgan et al., 2009东帝汶East TimorGQ500120Cooper et al., 2010马来西亚MalaysiaAY491974直接提交Direct submission微小按蚊An.minimus3泰国ThailandAF194495-504Sharpe et al., 2000中国ChinaAY007169-71Ma et al., 2005; 马雅军等, 2011柬埔寨CambodiaAY737081Ma et al., 2005; 马雅军等, 2011中国ChinaAF416783周水森等, 2002—AF230461Van Bortel et al., 2000—AY255108Garros et al., 2004印度IndiaDQ336436Prakash et al., 2006中国China/泰国Thailand/越南Viet-namDQ238494Chen et al., 2006中国ChinaFN646403直接提交Direct submission印度IndiaJQ845943Zomuanpuii et al., 2013雪足按蚊An.nivipes印度IndiaJN654424-32Sarma et al., 2012印度IndiaJN643727Zomuanpuii et al., 2013印度IndiaDQ279434-42Alam et al., 2007a印度IndiaDQ013796Alam et al., 2007a中国ChinaEU919722/EU650426马雅军等, 2011印度IndiaDQ013800/DQ336434/FJ159607直接提交Direct submission中国China FJ526621Morgan et al., 2009泰国ThailandFJ526622-23Morgan et al., 2009缅甸MyanmarFJ526624Morgan et al., 2009帕氏按蚊An. pattoni中国ChinaEU919719马雅军等, 2011菲律宾按蚊An.philippinensis印度IndiaJN643725Zomuanpuii et al., 2013印度IndiaDQ407724/JN654433-38/DQ319187/DQ159606直接提交Direct submission中国ChinaGU373719马雅军等, 2011印度IndiaFJ526616-17Morgan et al., 2009老挝LaosFJ526618Morgan et al., 2009泰国ThailandFJ526619Morgan et al., 2009柬埔寨CambodiaFJ526620Morgan et al., 2009伪威氏按蚊An.pseudowillmo-ri泰国ThailandDQ518628Walton et al., 2007越南VietnamDQ518629Walton et al., 2007中国ChinaAF512550/AF261952Ma et al., 2006; 马雅军等, 2011印度IndiaJQ446421-27Singh et al., 2012泰国ThailandFJ526572Morgan et al., 2009印度IndiaFJ526573-74Morgan et al., 2009缅甸MyanmarFJ526575Morgan et al., 2009老挝LaosFJ526576Morgan et al., 2009塞沃按蚊An.sawadwongporni泰国ThailandDQ518620Walton et al., 2007中国ChinaDQ518621Walton et al., 2007越南VietnamDQ518622Walton et al., 2007柬埔寨CambodiaDQ518623Walton et al., 2007

续表1
Tab.1Continued

种类Species测序样本信息Sequence featureGenBank登记号Accession number文献References越南VietnamAY803342-44直接提交Direct submission柬埔寨CambodiaAY803345直接提交Direct submission中国ChinaAF512551Ma et al., 2005, 2006; 马雅军等, 2011印度IndiaJQ446417-20Singh et al., 2012越南VietnamFJ526589Morgan et al., 2009柬埔寨CambodiaFJ526590Morgan et al., 2009印度IndiaFJ526591Morgan et al., 2009泰国ThailandFJ526592-93Morgan et al., 2009美彩按蚊An.splendidus—EF192276直接提交Direct submission印度IndiaEU366356直接提交Direct submission中国ChinaEU650427/EU919721马雅军等, 2011柬埔寨CambodiaFJ526600-01Morgan et al., 2009越南VietnamFJ526602Morgan et al., 2009泰国ThailandFJ526603-05Morgan et al., 2009斯氏按蚊An.stephensi—HQ703001/EF192275直接提交Direct submission印度IndiaEU359661-81Alam et al., 2008伊拉克IraqEU346652-53直接提交Direct submission伊朗IranDQ662409/DQ662406-07/AY365049/AY365050/AY157316/AY157678直接提交Direct submission伊朗IranAY702490/AY702482-6Djadid et al., 2006实验室品系Lab colonyFJ011430/FJ154840马雅军等, 2011—FJ526599 Morgan et al., 2009浅色按蚊An.subpictus—HQ703002/EF192277直接提交Direct submission越南VietnamGQ870325/GQ870330/AB731656直接提交Direct submission柬埔寨CambodiaGQ870326/GQ870329直接提交Direct submission印度尼西亚IndonesiaGQ870327/GQ870328/GQ870335直接提交Direct submission泰国ThailandGQ870333直接提交Direct submission缅甸MyanmarGQ870334直接提交Direct submission斯里兰卡Sri LankaGQ870336/GQ870337/AY049004/AF406613-16直接提交Direct submission印度IndiaEF601868-70/JQ845942直接提交Direct submission东帝汶East TimorGQ480827-28直接提交Direct submission棋斑按蚊An.tessellatus中国ChinaEU650425马雅军等, 2011迷走按蚊An.vagus印度IndiaJN710015/JN6437286Zomuanpuii et al., 2013印度尼西亚IndonesiaFJ654648-49Zarowiecki et al., 2011柬埔寨CambodiaAY737080Ma et al., 2005; 马雅军等, 2011中国ChinaEU919718/FJ457631马雅军等, 2011印度IndiaHQ873039直接提交Direct submission越南VietnamAB731658Kuwata et al., 2013东帝汶East TimorGQ500122/GQ480823-24直接提交Direct submission瓦容按蚊An.varuna印度IndiaJN643726/DQ478879/HQ873035-37直接提交Direct submission—AY255111Garros et al., 2004泰国ThailandAF194489-90Sharpe et al., 2000—AF230465Van Bortel et al., 2000威氏按蚊An.willmori中国ChinaAF512552Ma et al., 2006; 马雅军等, 2011印度IndiaJQ446411-12Singh et al., 2012不丹BhutanEU882061Somboon et al., 2008

—无测序样本信息,no information of sequenced sample。
1同物异名大劣按蚊A,synonym ofAn.dirusA;2同物异名微小按蚊C,synonym ofAn.minimusC;3同物异名微小按蚊A,synonym ofAn.minimusA。

2.2.2大劣按蚊: 已注册ITS2序列的大劣按蚊(广义)样本来自中国和泰国，共8条，样本信息描述为大劣按蚊和大劣按蚊D，此两型为据染色体核型不同而确定(Baimaietal.,1987；1988)。笔者比对了大劣按蚊D的5条ITS2序列(DQ629910-DQ629914)，结果显示其间差异性小于1.0%，其余序列因长度差异大，无法进行比对。

Walton等(1999)报道了泰国大劣按蚊复合体5种的ITS2序列(该文的所有序列未在GenBank中注册)，经比对发现泰国的大劣按蚊(原文大劣按蚊A)与我国海南标本(ADU60410)的序列完全一致；但白麦按蚊An.baimaii(Sallumetal.,2005)(原文大劣按蚊D)与我国云南的标本(ADU60411)相比，其序列在长度和碱基组成上均存在较大差异(泰国标本479 bp)。Walton的测序标本来自泰国白麦按蚊的模式产地，并经染色体鉴别确认，可靠性强；而我国大劣按蚊D的测序标本采自为云南勐腊，该采集地的大劣按蚊(广义)染色体核型被Baimai通过照片确定为大劣按蚊D(Xuetal.,1991)，而测序标本并未经染色体核型确认，则目前仍以大劣按蚊D表示，而与白麦按蚊的关系需进一步探讨。

2.2.3溪流按蚊: 已注册溪流按蚊ITS2序列共73条，样本来自印度和伊朗，尚无中国的样本，大多数测序样本信息描述为型S/T/U型或T1/T2/V/X/Y型。S/T/U型是依据溪流按蚊唾腺多线染色体2号臂上的固定倒位命名(Subbaraoetal.,1994)，T1/T2/V/X/Y型是依据ITS2序列特征命名(Naddafetal.,2002,2003; Manonmanietal.,2003；Chenetal.,2006)。笔者比对了所有的溪流按蚊序列，发现AF509348～53/AY172565与其他序列间差异性大于50%，查看后发现是因注册的序列是反向链导致；其余的溪流按蚊ITS2序列间差异最大为4.50%，差异程度无论与染色体型还是分子型均较难对应。

有学者将溪流按蚊的染色体型与分子型对应分析，显示94%的X型和90%的Y型分别与S型和T型相同(Manonmanietal.,2003)，也有报告显示100%的Y型与T型相同(Naddafetal.,2002,2003)。溪流按蚊T型又包括3个单倍型(T1,T2和Y)；U型与T型非常近似，推测是分布在局部地区的杂交种；ITS2序列的差异性提示尚存在分布于伊朗的V型和印度的X型(Chenetal.,2006)。Garros等(2005)依据D3序列特征指出，东南亚的溪流按蚊S型即哈里森按蚊，为同物异名。Chen等(2006)进一步指出印度的溪流按蚊S型与东南亚的哈里森按蚊为同种。之后，分别分析了溪流按蚊S型与哈里森按蚊的ITS2和核糖体DNA 28S编码区第2和3结构域(Ribosomal DNA 28S coding region,the second and the third domain D2-D3)序列，发现两者存在的差异，提出仍是独立种；同时认为溪流按蚊S型与X型为同物异名(Singhetal.,2006)；印度的溪流按蚊U型也为微小按蚊(Singhetal.,2010)等。由此可见，溪流按蚊的分类非常复杂，目前尚未达成共识，其隐种在我国的分类地位需进一步探讨。

2.2.4微小按蚊和哈里森按蚊: 微小按蚊的ITS2序列来源样本包括泰国、中国、印度、柬埔寨和越南，共21条；哈里森按蚊是据原微小按蚊染色体C型命名(Harbachetal.,2007)，已注册ITS2序列的样本来自泰国、缅甸、越南和中国，共7条。将两种的ITS2序列分别进行对齐和比对，显示微小按蚊与哈里森按蚊的种内差异均小于1%。

微小按蚊(广义)是包括多个成员种的复合体，依据ITS2特征，确定在我国分布微小按蚊和哈里森按蚊(周水森等，2002)。曾有根据海南省微小按蚊的形态和生态习性的变异定名的微小按蚊B(Yu,1987)，Chen等(2002)依据D3部分序列分析，认为应是微小按蚊的形态学变异；也有文献报道香港存在与微小按蚊近缘的分子型等(Harbachetal.,2006)。可见，微小按蚊复合体在我国相当复杂，仍需进一步探讨。

2.2.5多斑按蚊复合体: 目前已知多斑按蚊复合体包括有9种(Harbach,2012)，在我国分布的有5种(Maetal.,2006)，ITS2序列均有注册，即达罗毗按蚊(注册序列条数为8)、多斑按蚊(37)、伪威氏按蚊(16)、塞沃按蚊(18)和威氏按蚊(4)。笔者比对了各种内的序列，显示除多斑按蚊外，差异性均小于1%；多斑按蚊注册的序列较多，其中AF440197与其他序列的差异性大于50%，查看后发现也是因序列为反向链导致；EF192272与其他序列的差异性大于5%，BLAST搜索显示与斯氏按蚊的ITS2序列最为相似(97%)，猜测是样本鉴定错误；其余的ITS2序列间差异性小于1%。另外，多斑按蚊的5条序列(DQ518615-DQ518619)注册信息中显示，为K型，多斑按蚊K型目前已定名为Anophelesrampae(Somboonetal.,2011)，但上述序列BLAST搜索显示仍为多斑按蚊，故需更新样本信息。

2.2.6环纹按蚊复合体: 目前已知环纹按蚊复合体包括4种(Harbach,2012)，在我国分布的有3种，即环纹按蚊(30)、雪足按蚊(29)和菲律宾按蚊(16)(陆宝麟等，1987)，其ITS2序列均有注册。GenBank中注册ITS2序列的环纹按蚊样本信息描述中有种A和B，为依据卵巢的多线染色体的条带确定(Atrieetal.,1999)，序列比对结果显示，种A与B的ITS2序列差异大小在种内和种间存在重叠，均小于3%。雪足按蚊与菲律宾按蚊的形态非常近似，尤其是雌蚊和幼虫期难以辨别，两蚊种注册的ITS2序列在种内的差异均小于1%。

2.2.7其他按蚊: 笔者比对了31条注册的乌头按蚊ITS2序列，发现采自中国的EU650423与其他的差异范围为6.7%～8.5%，提示该种的序列需进一步核对。在41条斯氏按蚊ITS2序列中，除HQ703001和 EF192275外，其余序列间差异小于1%。

注册的浅色按蚊25条序列较为复杂，比对后发现EF192277和HQ192277与其他序列的差异大于50%，其余23条序列间的差异范围为0%～25.2%，测序样本来自越南、柬埔寨、缅甸、斯里兰卡、东帝汶、泰国、印度尼西亚和印度等8个国家，差异大应是浅色按蚊的形态学鉴别混乱导致。迷走按蚊的成蚊形态变异较大，准确鉴别也较为困难，且发现ITS2序列的多个位点在种内存在套峰(朱钊民等，2011)，故差异最大可达3.2%。

除上述和仅注册1条序列的蚊种外，其余的已注册的ITS2序列的塞蚊亚属种内差异性均小于1.0%。

2.3 ITS2序列在种间的差异

笔者选取在GenBank中注册的中国塞蚊亚属种类的其中1条ITS2序列作为蚊种的代表，进行种间序列差异分析，此处忽略了种内差异较大的溪流按蚊、乌头按蚊和浅色按蚊，结果显示差异范围为2.8%(大劣按蚊与大劣按蚊D)～68.3%(多斑按蚊与迷走按蚊)(表2)，与按蚊亚属蚊种间的差异性范围相似。

3 讨论

笔者在整理GenBank数据库中已注册的中国塞蚊亚属蚊种的ITS2序列时，发现仅有少数分布局限的尚无序列注册；与按蚊亚属相同的是，在已注册的序列中，由采自中国的样本测定的序列数量仍较少。通过分析已注册的ITS2序列，提示对于中国的塞蚊亚属大多数蚊种具有良好的解析度。

同时，笔者也发现ITS2序列在部分种内存在较大的差异性。分析其原因，其一，有些蚊种的进化快速且活跃，隐种近期或正在分化，已报告有的存在不同的染色体核型，如：溪流按蚊、库态按蚊、环纹按蚊和大劣按蚊等，其种内个体的差异体现在ITS2序列存在套峰，且序列的差异程度与染色体核型无法对应；其二，某些种类的成蚊形态变异较大，鉴别错误或混淆难以避免(大多为Sharma与Kaura提交的序列)，如：浅色按蚊、乌头按蚊、溪流按蚊、雪足按蚊和菲律宾按蚊等，其种内的差异较大，以至于难以确定种的特异序列。有鉴于此，塞蚊亚属部分蚊种目前尚难以依据注册的ITS2序列鉴别，其他分子标志应更为敏感和可靠(吴静等，2010)。

迄今，在学者报告新物种时，分子特征的佐证愈来愈重要，且从客观的分子特征发现新的类型，然后描述其形态特征，再命名新种，通常采用的是此技术路线，如：塞蚊亚属中的哈里森按蚊、An.rampae和白麦按蚊等。