qRT-PCR检测斯氏并殖吸虫不同虫期PsMt 01基因表达研究*

宋 蓓 康熙雄** 牛靖萱 王 英 张锡林

(1.首都医科大学附属北京天坛医院实验诊断中心，北京 100050; 2.第三军医大学基础部病原生物学教研室，重庆 400038)

半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteinase)是一类含半胱氨酸残基的蛋白水解酶,广泛存在于人类、寄生动物等多种动物体内(Parketal.,2002)。该蛋白酶除可作为一些寄生虫的免疫优势抗原外,还与虫体的入侵、免疫逃避以及虫株毒力等密切相关(王利芳等，2010)。我们从2-DE实验获得斯氏并殖吸虫Pagumogonimusskrjabini与免疫诊断相关的虫体蛋白(P.skrjabiniMetacercaria 01，PsMt 01)(牛靖萱等，2010)，与半胱氨酸蛋白酶酶类相关。本研究采用qRT-PCR技术，研究PsMt 01 mRNA在斯氏并殖吸虫不同虫期的表达，探讨其生物学功能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1斯氏并殖吸虫囊蚴：采集四川省兴文县斯氏并殖吸虫病流行区的锯齿华溪蟹Sinopotamondenticulatum，从中分离出斯氏并殖吸虫的囊蚴。

1.1.2实验动物：SD大鼠16只(体重150～200 g、雌雄不限)、雄性家犬购自于第三军医大学动物实验中心。

1.1.3并殖吸虫囊蚴感染动物：将SD大鼠分为4组，每组4只，分别腹腔注射50/只囊蚴。分别在3、7周，检获幼虫、童虫。雄性家犬经腹腔注射感染(200个囊蚴/条)，感染后90 d剖杀，从肺部检获成虫和虫卵。

1.2 试剂

Trizol试剂盒购于Bio Basic公司，qRT-PCR Kit(Perfect Real Time)购于大连宝生物公司。根据qRT-PCR引物设计要求，由上海赛百盛公司设计并合成引物。PsMt 01上游引物5′-AGGCGGCGTGCTCCTCCTCATA-3′，PsMt 01下游引物5′-TGGTTCGTGTTGGGCGTTCTCG-3′；18S上游引物5′-GGCATTTGTATGGCGGTGTT-3′，18S下游引物5′-GATCGTCAGTTGGCATC GTTTAT-3′。

1.3 方法

1.3.1RNA提取：应用Trizol试剂盒，按照说明书要求分别提取斯氏并殖吸虫的虫卵、囊蚴、幼虫、童虫、成虫的总RNA。以Nano Drop ND 1000微量紫外分光光度仪检测总 RNA 浓度。

1.3.2cDNA合成：应用东洋纺公司高效率逆转录试剂盒First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace-α合成cDNA。(1)RNA变性：总RNA 1 μL(<1 ng/μL)，RNase Free H2O 10 μL，Primer 1 μL，65 ℃ 水浴5 min，取出立刻冰上静置。(2)cDNA合成：变性RNA 12 μL，5×RT Buffer 4 μL，dNTPs 2 μL，RNase 1 μL，Rever TraAce 1 μL。30 ℃ 10 min，42 ℃ 20 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。产物瞬时离心，Nano Drop 1000紫外分光光度仪检测cDNA质量。

1.3.3PsMt01 cDNA模板梯度稀释：取1.5 μL的PsMt01 cDNA 模板加入1.5 μL的EASY Dilution稀释液管中，按照操作说明进行梯度稀释，得到1×10-4～1×100的PsMt01基因质粒作为模板进行荧光定量PCR扩增。

1.3.4qRT-PCR：取虫卵、囊蚴、幼虫、童虫、成虫的cDNA分别进行PsMt 01和18S 的SYBR Green I荧光定量PCR。每份标本同时检测PsMt 01和18S，同时设标准品组。按照TOYOBO反应试剂盒进行：SYBR 12.5 μL，上、下游引物各 1 μL，模板1 μL，无菌水加至总体积25 μL。反应程序为：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s，40个循环。反应结束后,数据分析软件将样本的扩增曲线与标准曲线对比,并结合内参自动计算出各样本的mRNA的表达量。

2 结果

2.1 RNA及cDNA质量鉴定

总RNA电泳显示可见较清晰的3条带，即为5S、18S、28S，表明提取的总RNA无降解，完整性和均一性较好(图1)。Naro Drop 1000紫外分光光度仪检测总RNA和cDNA，OD260/OD280均大于1.80。

图1 总RNA 1%琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Total RNA separated by 1% agarose gel electrophoresis

2.2 各个虫期qRT-PCR产物扩增结果

分别取5 μL各虫期qRT-PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见qRT-PCR产物扩增成功(图2-A)。结果显示该PsMt 01蛋白在虫卵期没有表达，但表达在从囊蚴期到成虫期，最高的表达量在0～7周的幼虫期和童虫期，这个阶段是寄生虫在宿主体内迁移活跃阶段。成虫期表达量较少。内参(18S)基因作为质控，检测cDNA生物质量(图2-B)，在虫体发育的各个时期持续表达。

图2 PCR产物扩增结果Fig.2 Transcription profile PsMt 01 in the developmental stagesA：PsMt 01蛋白不同时期的表达； B：18S.1:DNA marker DL2000;2:虫卵期;3:囊蚴期;4:幼虫期;5:童虫期;6:成虫期。A.PsMt 01 gene；B.18S.1：DNA marker DL2000；2：Egg； 3： Metacercaria； 4： Larva-5w； 5.Larva-7w； 6.Adult.

2.3 标准曲线

将PsMt 01基因质粒作为标准品，进行10倍梯度稀释同时进行定量PCR。标准曲线是将各个标准品的起始拷贝数取对数作为纵坐标，其所对应的循环闽值(Threshold cycle value，Ct)作为横坐标，即得到标准曲线(图3)。图中标准曲线线性关系良好回归系数R2=0.994，线性关系较好，说明定量结果准确可靠，标准曲线能准确反映待检样品的起始核酸量。

图3 PsMt01质粒标准曲线Fig.3 Standard curve for PsMt01 gene

2.4 溶解曲线

荧光染料在反应末尾对扩增产物进行溶解，溶解峰反映扩增产物的量。图4为标准品的溶解曲线，图示溶解曲线良好，背景干净，所有曲线只有一个主峰并且在相同的温度之间，说明引物的特异性高，扩增产物单一特异。

图4 标准品溶解曲线Fig.4 Standard molten curve

2.5 qRT-PCR扩增曲线

图5-A、5-B所示，扩增曲线平滑，荧光量的增长曲线符合标准“S”型，每条曲线均有明显的指数扩增期，基线平、无上扬，不同的标准起始模板数在反应后的平台期，产物量相差不大。曲线与曲线间平行性较好，说明各反应管扩增效率相近，定量的重复性和准确性较好。

2.6 PsMt 01在不同虫期的表达

图5 PsMt 01基因扩增曲线Fig.5 Amplification curves of 18S gene and PsMt 01A.18S基因; B.PsMt基因。A.18S gene; B.PsMt 01 gene.

图6 斯氏并殖吸虫PsMt 01表达趋势图Fig.6 Pagumogonimus skrjabini PsMt 01 expression trends1：虫卵期； 2：囊蚴期；3：幼虫期； 4：童虫期； 5：成虫期。1:Egg; 2: Metacercaria; 3:Larva-5w; 4:Larva-7w; 5: Adult.

qRT-PCR仪器自带软件生成PsMt 01表达图谱显示：与校正样品(18S)相比PsMt 01(目的基因)的基因表达水平(图6)。图中显示，PsMt 01 mRNA主要表达在囊蚴期(39.34±0.26)，幼虫期(42.56±0.35)及童虫期(44.12±0.56)，并且是逐步升高趋势，成虫期(27.64±0.77)表达较少，虫卵期没有表达。

3 讨论

qRT-PCR技术通过检测各种组织细胞中基因表达丰度来分析该基因的表达调控，并可监控其mRNA的表达模式。目前，qRT-PCR主要用于检测组织中含量较少的基因，对不同组织中基因的转录水平进行定量分析。近期，有学者采用实时荧光共振能量转移PCR(real-time FRET PCR)以解链曲线检测实验感染猫粪便的异盘并殖吸虫Paragonimusheterotremus虫卵，最低可检出每克被异盘并殖吸虫感染猫粪便中含有10 个虫卵。该方法能用于异盘并殖吸虫感染情况的检测和流行病学研究(Tantrawatpanetal.2013)。本实验采用qRT-PCR技术对PsMt 01 mRNA在斯氏并殖吸虫不同虫期(虫卵、囊蚴、幼虫、童虫、成虫)的表达进行研究，通过分析PsMt 01 mRNA在不同发育时期的表达变化情况，推断PsMt 01蛋白在虫体发育时期的生理学功能。

PsMt 01是本实验室从2-DE实验获得蛋白，经De Novo肽测序分析主要与半胱氨酸蛋白酶酶类相关。有文献报导，哺乳动物半胱氨酸蛋白酶的研究主要集中在凋亡机制方面。半胱氨酸蛋白酶作为寄生虫主要的消化酶，在维护寄生虫本身细胞生理及功能上起着重要的作用，通过降解宿主组织、摄取营养和免疫逃避来维持在宿主体内的寄生，在寄生虫的生存及与宿主的相互关系上具有重要的作用 (Moncadaetal.，2003)，涉及虫体的毒力、对组织和细胞的侵袭力以及免疫逃避等多个方面(Kangetal.，2010)。在自由生活阿米巴中,致病株(如卡伯特森氏棘阿米巴)较非致病株具有更高的半胱氨酸蛋白酶活性,由此推断在寄生虫感染的致病机制中半胱氨酸蛋白酶起着重要的作用(Dixitetal.，2008)。本研究qRT-PCR结果表明：PsMt 01 mRNA在虫卵期尚未表达，至囊蚴期表达为39.34±0.26，幼虫期为42.56±0.35，其表达量随发育进程呈现逐步升高趋势，至童虫期达到峰值44.12±0.56，在成虫期表达减低为27.64±0.77。PsMt 01 mRNA表达量在0～7 周的幼虫期和童虫期最高，此阶段是斯氏并殖吸虫在宿主体内迁移活跃时期。因此推断PsMt 01蛋白在虫体发育的早期发挥着重要作用，可能与免疫逃避和组织迁移等活动相关。

近年来，寄生虫半胱氨酸蛋白酶得到了越来越多学者的关注(Shareefetal.，2014)。本研究从基因转录水平对半胱氨酸蛋白酶在不同虫期的表达水平进行研究，探讨阐述其生物学功能。不仅有助于揭开寄生虫与宿主相互作用的机制，也为进一步研究提供理论依据。