双水相与超声耦合提取玫瑰花渣中的总黄酮

郭 英，高云涛

(1.郧阳师范高等专科学校化生系，湖北十堰442000;2.云南民族大学民族药资源化学国家民委－教育部重点实验室，昆明650500)

玫瑰花是蔷薇科蔷薇属多年生常绿或落叶性灌木［1］，作为一种节日主要切花，在全国各地均有种植［2］。玫瑰花是一种食药皆宜的花卉，能理气散淤、和血养血和镇静安神，具有治疗心悸气短和阴虚体弱的功效［3］。除此之外，玫瑰花是玫瑰精油的提取原料。水蒸气蒸馏提取玫瑰精油过程中会产生大量的玫瑰花渣，其含有一定量的黄酮类化合物等有效成分［4］。但目前玫瑰花渣多作为废弃物扔掉，不仅浪费资源，而且污染环境。

黄酮类化合物可防治心脑血管系统和呼吸系统的疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、抗辐射、抗癌、抗肿瘤等多种药理活性［5］。目前，黄酮类化合物的提取方法为有机溶剂提取、热水提取、碱提法、微波提取法、超声波提取法［6］等。超声波提取利用了超声波的空化效应使黄酮类化合物溶出，具有省时、高效、节能的特点［7］。双水相萃取［8］是基于液－液萃取原理，同时考虑到保持生物活性所开发的一种新型萃取分离技术，具有分相时间短、易于连续操作、目标产物分配系数大、投资费用少等特点，是一种较为经济、简单、灵敏度高和应用范围广的分离手段。高云涛等提出超声－双水相耦合提取新方法［9］，方法融合了超声的高效提取及双水相分离的优势，提取率和产物纯度高。在此基础上，本文将超声－双水相耦合提取方法应用于玫瑰花渣中黄酮的提取，结果令人满意。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

玫瑰花渣(昆明酷特利生物科技有限公司)，提取前用真空干燥，并粉碎机粉碎至80目(0.18mm)以下。芦丁标准品(购于sigma公司)，5%NaNO2溶液，10%Al(NO3)3溶液，4%NaOH溶液，(NH4)2SO4，正丙醇，无水乙醇，石油醚，所用试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

1.1.2 仪器

AS3120A超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);7200型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);电子天平。

1.2 实验方法

1.2.1 浊点滴定(双水相的形成)

准确称取100 g(NH4)2SO4，溶于水，于250 mL容量瓶中配成40%的(NH4)2SO4水溶液。分别取一定体积，稀释，得到4% ～40%的(NH4)2SO4水溶液。取5 mL于25 mL比色管中，用正丙醇进行滴定。滴定过程中，每隔几秒摇动比色管，使(NH4)2SO4水溶液与正丙醇混合均匀，并仔细观察，直至比色管出现浑浊。静置，使其稳定分相。记录滴定管读数。继续用蒸馏水滴定至混合液又由浑浊变澄清，记下读数。如此反复滴定，根据浊点时消耗的正丙醇体积和变澄清时消耗的水的体积，计算各组分的含量。此情况下形成的是盐溶液占优势的双水相体系。另外，取不同体积分数(20% ～90%)的正丙醇水溶液，用40%的(NH4)2SO4水溶液进行滴定，方法同上。最后，以正丙醇体积分数为纵坐标，(NH4)2SO4质量分数为横坐标，绘制正丙醇—(NH4)2SO4双水相体系形成过程中的浊点曲线图。

1.2.2 标准曲线的制作［9］

精确称取经105℃干燥恒重的芦丁对照品20 mg，置l00 mL量瓶中。加80%乙醇溶解至刻度，摇匀即得到质量浓度为0.2 mg/mL的对照品溶液。精密吸取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 、5.0、6.0、7.0、8.0 mL对照品溶液分别置于25 mL比色管中，各加30%乙醇定容至10 mL，加5%NaNO2溶液1 mL，摇匀放置6 min;再加10%Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀，再放置6 min;加4%NaOH溶液10 mL，用蒸馏水定容至刻度，摇匀放置15 min。以蒸馏水作参比，用1 cm比色皿于波长510 nm处测其吸光度。以吸光度为纵坐标，以芦丁标准溶液的质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

用最小二乘法进行回归，得到吸光度和芦丁标准溶液的质量浓度的回归方程:y=12.546x+0.0058，R2=0.9998。这表明该方法在0.008～0.064 mg/mL范围内呈良好的线性关系，可用于玫瑰花渣提取物中总黄酮含量的测定。

1.2.3 玫瑰花渣总黄酮的提取

用植物粉碎机将玫瑰花渣碎至约0.180 mm(80目)。准确称取1.00 g于100 mL具塞锥形瓶中，加入25 mL正丙醇－(NH4)2SO4双水相体系溶液，静置1 h，超声30 min后，抽滤。将滤液转入60 mL分液漏斗中，静置，待完全分相后，取上层清液，量体积。加入同体积的蒸馏水，0.2倍体积的石油醚，摇匀，静置。待完全分相后，取下相清液，用30% 乙醇定容，作为待测液。

1.2.4 玫瑰花渣总黄酮的测定

按前述 NaNO2－A1(NO3)3比色法［10］，按照1.2.2的方法对样品溶液中总黄酮含量进行测定，得到不同条件下的吸光度值。利用芦丁标准曲线方程进行计算，从而得到提取液中的总黄酮含量:总黄酮得率 =(提取液中总黄酮质量/原料质量)×100%。

2 结果与讨论

2.1 浊点滴定曲线

按照1.2.2的实验方法制作正丙醇—(NH4)2SO4双水相体系的浊点滴定图，结果如图1。

图1 浊点滴定曲线Fig.1 The titration curve of turbid point

由图1可看出，加入正丙醇量越大，恰好分相时，所需(NH4)2SO4的量就越小;反之，体系中(NH4)2SO4质量分数越高，恰好分相时所需的正丙醇体积分数就越低。同时从该图也看出，当正丙醇为某一定值时，(NH4)2SO4质量分数也必须高于上图所对应的最低值才能保证分相。如，在正丙醇体积分数为34.78%时，(NH4)2SO4在整个体系中的质量分数必须达到5.22%以上，否则无法形成双水相。即当成相物的浓度在该曲线以下时，将不能形成双水相体系。

2.2 最佳提取工艺的确定

影响超声提取的因素很多，如溶剂种类、超声时间、超声功率、温度、溶剂用量、提取次数以及提取时间等。本文重点研究了正丙醇体积分数、超声时间、(NH4)2SO4用量、料液比4个因素对玫瑰花提取物中总黄酮得率的影响。通过单因素实验筛选出对总黄酮得率影响显著的因素，并确定出各因素的最佳水平范围。

2.2.1 (NH4)2SO4用量对提取效果的影响

在正丙醇体积分数保持60%的情况下，分别向 10 mL 水溶液中加入 0.65、0.8、1.2、1.6、1.4、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4 g(NH4)2SO4固体。使其充分溶解后，加入15 mL正丙醇，振荡使形成稳定双水相。此时，在双水相体系中(NH4)2SO4质量分数分别为2.6%、3.2%、4.8%、6.4%、8%、9.6%、11.2%、12.8%、14.4%、16%。分别加入玫瑰花渣粉末各1 g，按照1.2.3的提取方法进行提取，得到(NH4)2SO4用量对提取效果的影响，实验结果如图2所示。

图2 (NH4)2SO4用量对提取效果的影响Fig.2 The effects of ammonium(w%)amount on extraction

由图2可看出，随着(NH4)2SO4用量的升高，吸光度逐渐增大，而当体系中(NH4)2SO4质量分数达到12.8%后，吸光度开始下降，这是因为(NH4)2SO4量大会带走更多的水，使有机相中的水量减少，而有些黄酮类物质是水溶性的，故而使有机相中的黄酮含量减少，综合各种因素，(NH4)2SO4用量以体系中(NH4)2SO4质量分数为12%为宜。

2.2.2 超声时间对提取效果的影响

用一定浓度的(NH4)2SO4溶液与正丙醇混合制成双水相，浸泡样品，并正使丙醇体积分数为60%，体系中(NH4)2SO4质量分数为12%。按照1.2.3的提取方法进行提取，考察超声时间对提取效果的影响，实验结果见图3。由图3可知，随着超声时间的增大，吸光度先升高后降低，根据图中显示选30 min作为最佳超声提取时间。

图3 超声时间对提取效果的影响Fig.3 The effects of ultrasonic time on extraction

2.2.3 正丙醇体积分数对提取效果的影响

用一定浓度的(NH4)2SO4溶液与不同体积的正丙醇混合制成双水相，浸泡样品，并使正丙醇体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%。体系中(NH4)2SO4质量分数为12%，超声时间为30 min，按照1.2.3的提取方法进行提取，得到正丙醇体积分数对提取效果的影响曲线，见图4。由图4可看出，选用50%的正丙醇体积分数进行双水相提取最佳。

图4 丙醇浓度对提取效果的影响Fig.4 The effects of volume fraction of propanol on extraction

2.2.4 料液比对提取效果的影响

用一定浓度的(NH4)2SO4溶液与正丙醇混合制成双水相，浸泡样品，并使丙醇浓度体积分数为50%，体系中(NH4)2SO4质量分数为12%，超声时间为 30 min，分别用 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 的料液比(g/mL)按照 1.2.3的提取方法进行提取，得到料液比对提取效果的影响曲线，见图5。

图5 料液比对提取效果的影响Fig.5 The effects of ratio of solid to solution on extraction

由图5可知，随着料液比的增大，吸光度逐渐增大，但是考虑到料液比过大，会增加成本，所以选用1∶40的料液比进行双水相提取，即1 g样品对应40 mL的提取溶剂。

2.2.5 玫瑰花渣提取物总黄酮双水相提取工艺的确定

按上述单因素实验得出最佳提取工艺条件为:体系中(NH4)2SO4质量分数为12%、正丙醇体积分数为50%、料液比(g/mL)为1∶40、超声提取时间为30 min。按照该工艺对玫瑰花渣中总黄酮物质进行超声耦合正丙醇－(NH4)2SO4双水相提取，重复3次实验，得到总黄酮的平均得率为3.42%。

3 结论

1)将超声波技术和双水相萃取技术耦合用于提取玫瑰花渣中总黄酮。通过单因素实验得出最佳提取工艺条件为:体系中(NH4)2SO4质量分数为 12%、正丙醇体积分数为 50%、料液比为1∶40(g/mL)、超声提取时间为30 min。在此工艺条件下，得到总黄酮平均得率为3.42%。

2)本文的研究表明，超声波与丙醇－(NH4)2SO4双水相体系可方便实现耦合集成，并缩短提取时间、提高得率，降低提取温度，有利于热敏成分的分离，获得高纯度高活性的黄酮类物质，在生物活性成分的提取分离［11］领域展现了良好的应用前景。

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