电针丰隆穴对高脂血症大鼠腹腔巨噬细胞CD11b、ICAM-1表达的影响

王琼,田佳玉,肖颖,张红星

(武汉市中西医结合医院,武汉 430022)

高脂血症是由于体内脂质代谢紊乱而形成的血浆脂质中一种或多种成分的浓度超过正常高限的一种病症。它是导致动脉粥样硬化症的主要危险因素,与高血压、冠心病、脑血管疾病等密切相关。近年来,随着高脂血症发病率的升高,动脉粥样硬化的危险性也相应增加。因此,有必要积极预防和及时控制血脂水平[1]。临床上,药物性降脂治疗较为常用且效果肯定,但降脂药物对肝肾功能有损害,因此有其局限性[2]。大量报道均已证实[3-5],针灸疗法以方法多、操作简易、无毒副反应等特点,已应用于高脂血症的临床治疗,且取得一定成效[6-8]。本研究通过观察电针高脂血症大鼠的丰隆穴,对其腹腔巨噬细胞表面抗原CD11b、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响,明确电针在治疗高脂血症中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康SD大鼠40只,雄性,体重180～200 g,由湖北省动物实验中心提供,动物合格证号为[SCXK(鄂)2008-0004]。根据随机数字表分为正常对照组、高脂饲料组、高脂饲料治疗组、高脂＋普通饲料组及高脂＋普通饲料治疗组,每组8只大鼠。

1.2 主要药品与仪器

流式细胞仪(美国ABI公司),抗大鼠CD11b-PERCP单克隆抗体(美国eBioscience公司),抗大鼠ICAM-1-FITC单克隆抗体(美国eBioscience公司),1640培养液,PBS缓冲液(美国 HyClone公司),Ionomycin,莫能霉素(美国 ENZO公司),PMA,多聚甲醛(美国 SIGMA公司),皂苷(美国 Amresco公司),0.1%BSA(瑞士 Roche公司),LH202H型韩氏穴位神经刺激仪(北京华威有限公司),0.25 mm×25 mm不锈钢针灸针。

1.3 动物造模

正常对照组大鼠用普通大鼠饲料自然喂养,高脂饲料组、高脂饲料治疗组、高脂＋普通饲料组及高脂＋普通饲料治疗组大鼠用高脂饲料[9](猪油 10%,蛋黄粉5%,胆固醇1%,丙基硫氧嘧啶0.2%,脱氧胆酸钠0.5%,蔗糖 5%,基础饲料 78.3%)喂养,其中高脂＋普通饲料组及高脂＋普通饲料治疗组大鼠用高脂饲料喂养28 d后,换用普通饲料,同时对高脂饲料治疗组及高脂＋普通饲料治疗组大鼠进行电针丰隆穴治疗。

1.4 治疗方法

取穴参照《实验针灸学》[10],选取双侧丰隆穴,模拟人体经穴定位。丰隆穴在大鼠膝关节外侧后三里下1 mm,腓骨小头下约5 mm处。用0.25 mm×25 mm针灸针,对丰隆穴直刺 7 mm,快速捻转至针下有沉涩感后,接韩式穴位神经刺激仪,等幅疏密波,频率为2/100 Hz,电流强度2 mA,以动物肢体微颤为度,每次治疗时间为30 min,每天1次,连续治疗28 d。常规温度、湿度及统一饮水喂养。

1.5 血脂的检测

所有SD大鼠经颈动脉用肝素钠试管采血4～5 mL,上、下缓慢颠倒3次混匀。4℃离心(3000 r/min)10 min,取上层血清2 mL,置入EP管中,﹣20℃冰箱保存。送至我院检验科,根据各指标试剂盒说明书,采用Olympus AU2700型全自动生化分析仪,检测血浆中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量。

1.6 流式细胞仪检测

检测大鼠腹腔巨噬细胞表面抗原 CD11b、细胞间黏附分子(ICAM-1)的分子表达水平。

1.6.1 提取大鼠腹腔巨噬细胞

参照兰青等[11]的方法来提取大鼠腹腔巨噬细胞,具体步骤如下。引颈杀死大鼠,手提尾鼠将全鼠浸入70%乙醇中浸泡5 min后,再将大鼠倒立提起,从腹腔一侧近腹股沟处注入1640培养液30～50 mL,仰卧平放并用手指轻柔大鼠腹部3 min,静置5 min后,在超净工作台上打开大鼠腹腔,观察肠管变扁且腹腔液为淡黄色时,用无菌滴管吸取腹腔液约 10 mL,1200 r/min离心8 min。去上清,留下离心管底部乳白色沉淀,1640培养液调整细胞至所需浓度。

1.6.2 固定及染色

将分离后的巨噬细胞液加至96孔U型板,0.2 mL 1×107/mL,加入PMA(5 ng/mL)、ionomycin (500 ng/mL)和莫能霉素(Monensin)(终浓度为2 μM)置37℃、5%CO2孵箱培养4 h后收集细胞,PBS洗1次,调整细胞浓度1×107/mL,50 μL细胞加入抗 CD11b抗体,4℃孵育30 min,PBS洗2次,4%多聚甲醛固定4℃,30 min。PBS洗2次,第2次用含0.1%的皂苷,0.1%BSA的PBS洗细胞,调整细胞浓度 1×107/mL,50 μL细胞加入 ICAM-1抗体,4℃孵育 30 min, PBS洗 2次,PBS重悬细胞至0.3 mL,流式细胞仪检测。

1.6.3 设置流式检测对照

①空白孔 2×105/0.3mL细胞;②2×105/0.3mL细胞加CD11b抗体;③2×105/0.3mL细胞加ICAM-1抗体;④2×105/0.3mL细胞加CD11b抗体＋ICAM-1二标。

1.7 统计学方法

采用 SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析,继以 LSD检验,实验结果以均数±标准差表示,CD11b与ICAM-1相关性使用相关性分析,以P＜0.05为具有统计学意义,一致性检验采用Bland-A ltman分析[12]。

2 结果

2.1 电针丰隆穴对高脂血症大鼠血脂水平的影响

由表1可以看出,与正常对照组相比,高脂饲料组大鼠血浆 TC、LDL-C明显上升(P＜0.01),而 TG和HDL-C变化不明显(P＞0.05);高脂＋普通饲料组大鼠血浆TC、LDL-C与高脂饲料组比较明显下降(P＜0.01),较正常对照组仍明显升高(P＜0.01);高脂饲料治疗组与高脂饲料组比较,TC和LDL-C明显下降(P＜0.01),高脂＋普通饲料治疗组大鼠TC、LDL-C与高脂＋普通饲料组比较,明显降低(P＜0.01),TG和HDL-C变化不明显(P＞0.05)。

表1 各组大鼠血脂变化 (±s,mmol/L)

表1 各组大鼠血脂变化 (±s,mmol/L)

注:与正常对照组比较1)P＜0.05,2)P＜0.01;与高脂饲料组比较3)P＜0.01;与高脂＋普通饲料组比较4)P＜0.01

组别 n TC TG HDL-C LDL-C正常对照组 8 1.60±0.37 0.58±0.21 0.67±0.08 0.21±0.07高脂饲料组 8 10.91±3.012) 0.51±0.11 0.81±0.21 5.43±1.012)高脂饲料治疗组 8 5.16±0.822)3) 0.57±0.16 0.61±0.18 1.29±0.311)3)高脂＋普通饲料组 8 6.79±1.052)3) 0.67±0.19 0.62±0.14 2.31±0.652)3)高脂＋普通饲料治疗组 8 3.16±0.473)4) 0.52±0.17 0.72±0.18 0.69±0.453)4)

2.2 电针丰隆对高脂血症大鼠腹腔巨噬细胞CD11b、ICAM-1的影响

由表 2可以看出,高脂饲料组大鼠巨噬细胞CD11b、ICAM-1表达率较正常对照组明显上升(P＜0.01),高脂＋普通饲料组大鼠巨噬细胞 CD11b、ICAM-1表达率较高脂饲料组明显下降(P＜0.05),较正常对照组仍明显上升(P＜0.01),高脂饲料治疗组与高脂饲料组比较,CD11b、ICAM-1表达率明显下降(P＜0.01),高脂＋普通饲料治疗组与高脂＋普通饲料组比较,CD11b、ICAM-1表达率明显降低(P＜0.01),高脂＋普通饲料治疗组与高脂饲料治疗组比较,CD11b、ICAM-1表达率明显降低(P＜0.01)。

表2 各组大鼠巨噬细胞CD11b、ICAM-1表达率的变化(±s)

表2 各组大鼠巨噬细胞CD11b、ICAM-1表达率的变化(±s)

注:与正常对照组比较 1)P＜0.05,2)P＜0.01;与高脂饲料组比较 3)P＜0.05,4)P＜0.01;与高脂＋普通饲料组比较5)P＜0.05,6)P＜0.01

组别 n CD11b(%)ICAM-1(%)正常对照组 8 16.29±1.73 2.04±0.63高脂饲料组 8 65.14±3.742) 18.21±2.442)高脂＋普通饲料组 8 48.73±2.272)3) 11.99±1.262)3)高脂饲料治疗组 8 36.91±2.542)4)6) 5.80±1.244)6)高脂＋普通饲料治疗组 8 26.49±2.121)4)6) 3.93±0.351)6)

2.3 CD11b与ICAM-1相关性分析

直线相关分析结果表明,CD11b与ICAM-1水平呈显著正相关(r=0.947,P＜0.01)。详见图1。

图1 CD11b表达与ICAM-1表达的关系

3 讨论

高脂血症在中医学典籍中并无相关记载,《内经》对膏脂的正常功能及代谢异常均有描述:“五谷之津液,和合而为膏者,内渗于骨空,补益脑髓,而下流于阴股。”“高粱之变,足生大丁。”近年来,众多医家将其归于“痰证”、“瘀证”范围。中医学理论认为,高脂血症的产生与肝、脾、肾三脏关系最为密切,其病机为饮食肥甘厚味,损伤脾胃,同时肝胆疏泄功能不畅,不能泌输精液而引起脾之消谷、运化功能失调,转化为痰浊;或肾之阴阳俱虚,相火妄动,致肝阳上亢,甚则化火,木旺则乘土,使脾胃输布功能失调,湿热郁结,痰浊、瘀血内生而阻塞血脉。其治疗以化痰降浊、活血化瘀治其标,健脾益气,强本清源治其本。

丰隆穴是足阳明胃经之络穴,通脾胃二经,既可健胃,又可运脾,在调理脾胃功能、调节血脂方面具有显著的疗效,具有祛痰、和胃降逆和健脾益胃的作用,《玉龙歌》载“痰多宜向丰隆寻”,为化痰首选穴。中医学的“痰”与自由基代谢异常有关,现代研究显示[13],丰隆穴的化痰作用不仅与调节血脂有关,而且能改善机体的自由基代谢。

胆固醇由食物及体内生物所合成,对机体组织来说,维持胆固醇的供给,确保其代谢平衡是及其重要的。若机体总胆固醇太高,超过所合成和生物膜、胆汁酸及类固醇激素等物质的需要时,胆固醇则会沉积于动脉内皮下的巨噬细胞中,引起内皮下变形,从而致使血小板在动脉内壁集聚。如果同时还伴动脉壁损伤及胆固醇转运障碍,则会在动脉内膜形成脂斑,从而导致动脉管腔变窄,引发动脉粥样硬化的发生。血中胆固醇主要由LDL-C携带运输,通过细胞膜上LDL-C的受体介导的内吞作用进入细胞。当细胞内胆固醇过高时,可抑制LDL-C受体的补充,从而减少由血中摄取的胆固醇。本实验结果显示,电针丰隆穴治疗高脂血症大鼠后,大鼠血浆中TC、LDL-C明显降低。说明了针刺丰隆穴降脂的效果是十分显著的,从而能起到一定的预防动脉粥样硬化的作用。此外,高脂＋普通饲料组大鼠血浆TC、LDL-C较高脂饲料组明显降低,说明了控制高脂饮食对高脂血症的转归具有良性作用。

高脂血症不仅是动脉粥样硬化的促发因素,而且贯穿其发生、发展的过程当中,和内皮功能改变、白细胞黏附、细胞因子改变等相互交织,相互影响,相互作用[14]。外周血单核细胞迁入动脉内皮下间隙,分化成巨噬细胞是动脉粥样硬化的最早事件,这一事件的发生至少需要两个条件,即单核细胞的活化和黏附分子的参与。整合素家族的CD1lb是黏附家族的重要成员之一,在白细胞黏附于血管内皮细胞中起突出作用。实验证实,活化粒细胞和单核细胞的 CD1lb表达量显著增加,CDllb在白细胞表面的表达已成为白细胞活化的标志[15]。ICAM-l为CD11b的配体,ICAM-1基因启动子上有1个基本的NF-κB位点,VCAM-1基因有2个NF-κB位点。ICAM-1、VCAM-1、E-sel能与白细胞表面的配体相应地结合,介导白细胞的贴壁黏附,致白细胞聚集、浸润,从而导致局部炎症的发生[16]。黏附分子CD11b与ICAM-1的表达影响着中性粒细胞的跨内皮移行作用,且这两种分子有协同作用。两者同样在白细胞的黏附及迁移中扮演着重要的角色。NF-κB活化后能调控一系列基因的表达,如黏附分子家族的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)等,研究表明[17],ADP激活的血小板能诱导内皮细胞分泌MCP-1,促进其表面表达 ICAM-1,NF-κB的激活是动脉粥样硬化的始动机制。

实验结果显示,高脂饲料组大鼠巨噬细胞CD11b、ICAM-1表达率较正常对照组明显上升,表明高脂血症大鼠模型成功,大鼠处于炎症状态。高脂＋普通饲料组大鼠巨噬细胞CD11b、ICAM-1表达率较高脂饲料组明显下降,较正常组仍明显上升,说明合理的饮食对控制高脂血症有一定疗效,但疗效有限[18],仍需结合针灸进行治疗。高脂＋普通饲料治疗组与高脂饲料治疗组比较,CD11b、ICAM-1表达率明显降低;直线相关分析结果显示,CD11b与 ICAM-1水平呈显著正相关,表明CD11b与ICAM-1在抑制炎症反应方面有一定的协同作用,这与Zhang等[19]研究是相符的。此外,电针丰隆穴能够改善高脂血症引起的炎症反应,其机制可能由于电针丰隆穴下调CD11b及黏附分子ICAM-1高表达,抑制NF-κB的激活,从而阻断NF-κB调控的炎症反应,改善其介导的微循环障碍,减轻机体组织的损伤。然而,这一过程涉及到的机制是十分复杂的,未来对此还需要更深一步的研究探索。

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