激光穴位照射佐剂性关节炎大鼠的生物效应累积及其镇痛疗效观察

马力佳,杨华元

(上海中医药大学,上海 201203)

炎症痛是临床上最常见的病理性疼痛之一,它的病程迁延反复,治愈难度大。已有实验证明半导体激光针灸对缓解炎性疼痛有很好的疗效[1]。本实验采用传统针刺治疗与半导体激光穴位照射治疗炎性疼痛,通过对AA大鼠血清中IL-1、IFN-γ、TNF-α含量的观察,探讨半导体激光镇痛的疗效以及其生物效应的特性,为下一步深层次探索激光的生物效应和指导临床治疗炎性疼痛提供实验研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

清洁级健康成年SD大鼠80只,雄性,体重180～220 g,由上海中医药大学动物实验中心提供。饲养环境温度(24±2)℃,湿度控制在(45±5)%,适应性饲养1星期,普通饲料喂养,自由饮水。

1.1.2 主要仪器设备

YLS-12A型鼠尾光照测痛仪(北京吉安得尔科技有限公司),半导体激光发光管(上海科技京城),YJ82/1型双路直流稳压电源(上海沪光仪器厂),华佗牌无菌针灸针(苏州医疗用品厂)。

1.1.3 主要试剂

完全弗氏佐剂(Complete Freund’s adjuvant,CFA,购自美国 Sigma公司),水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司),ELISA试剂盒(白介素细胞-1、肿瘤坏死因子α、干扰素γ,购自南京建成生物工程有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 佐剂性关节炎大鼠模型制备

制备大鼠完全弗氏佐剂性外周急性炎症痛模型,在严格无菌条件下,于每只大鼠右后足跖皮下注射弗氏完全佐剂0.1 mL。造模后4 h起大鼠右足足趾至踝关节逐渐出现红肿疼痛,不能着地,跛行,各种行为学、形态学改变,痛阈值下降,示造模成功。

1.2.2 动物选穴

穴位选择大鼠右侧足三里穴。足三里(后三里)位于膝关节后外侧,在腓骨小头下约5 mm处。取穴方法参照《实验针灸学》[2]及根据大鼠形态、解剖、生理特点而定。针刺7 mm。

1.2.3 实验分组及干预方法

80只SD雄性大鼠随机分为8组,每组10只。空白组、模型组大鼠置于大鼠固定器内固定,每天固定1次,固定时间每日20 min。

激光照射3 d组、5 d组、7 d组:将大鼠置于大鼠固定器内固定,取右侧患肢足三里穴,激光照射20 min,每日 1次,分别治疗 3 d、5 d、7 d。激光波长650 nm,输出功率5 mW,光斑直径3 mm。

针刺3 d组、5 d组、7 d组:将大鼠置于大鼠固定器内固定,用0.30 mm×25 mm毫针针刺右侧患肢足三里穴20 min,行平补平泻手法,每日1次,分别治疗3 d、5 d、7 d。

1.2.4 取材

空白组、模型组与各治疗组在各自疗程结束并进行体重测量,肿胀度测量及痛阈测定后,用 10%水合氯醛以0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉,进行眼眶后静脉丛取血1.5 mL,分离血清,放置于﹣80℃低温冰箱保存待测。

1.3 指标检测

1.3.1 体重及一般整体情况观察

于造模前、治疗后取材前观察各组大鼠皮毛色泽、饮食、粪便、活动度等一般情况,测量大鼠体重,观察其变化规律。

1.3.2 痛阈测定

于造模前、造模后、治疗后采用光照甩尾法进行痛阈测定。为防止大鼠灼伤,设定鼠尾测痛仪功率为38 W,照射截止时间为 16.01 s,以防大鼠尾部灼伤。将待测大鼠用大鼠固定器固定,暴露整条尾巴,将尾尖对准测痛仪上的黑线,尾尖部遮盖住光斑。待大鼠稳定后,按开始键计时,当鼠尾因热辐射致疼痛而发生甩尾,尾尖离开光斑,计时自动停止,记录时间,单位为s。每只大鼠分别进行3次测量,每隔5 min测量1次,最后取3次测量结果的平均值为该天测量的痛阈值。

1.3.3 踝关节周长测量

各组大鼠于造模前及造模第3天进行右后肢踝关节周长测定,用大鼠固定器将大鼠固定,两后肢外露,自然下垂。用带刻度的无弹性软尺沿大鼠右后肢内外踝下缘平面绕踝一周,测得长度即为踝周长。为保证数据准确性,操作者每次掌握同样的力度进行测量。

1.3.4 IL-1、TNF-α、IFN-γ、TLR4 含量的测定

大鼠血清样本采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定,以450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值),测定应在加终止液后10 min以内进行。根据标准品的浓度及对应的 OD值计算出标准曲线的直线回归方程,再算出对应的样品浓度。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS19.0软件进行分析,数据呈正态性分布,所有结果以平均值±标准差表示。各组组间差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA),组间比较采用多重比较(LSD)分析,以P＜0.05作为有统计学意义的标准。

2 结果

2.1 一般情况及体重、踝关节肿胀度变化

模型组与空白组大鼠相比,在造模期间活动减少,精神萎靡,对外界刺激反应较迟钝,饮食减少,粪便稀溏,毛色晦暗,毛发凌乱,右足跛行。模型组大鼠踝关节在造模12 h出现右足红、肿、触摸肤温发热,尤其在造模后24 h更为明显。与模型组比较,治疗后各组的一般状况有所改善,活跃度较高,进食增加,毛发较顺滑洁净。

造模后模型组大鼠体重均值明显小于空白组,具有统计学差异(P＜0.05),而各治疗组大鼠体重均值与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05),且激光治疗组大鼠体重高于针刺治疗组,说明激光治疗疗效比针刺治疗疗效显著。详见表1。

造模后模型组与空白组对比,大鼠踝关节肿胀度具有差异性(P＜0.05),显示造模成功;所有治疗组与模型组比较差异均具有统计学意义(P＜0.05);且激光3 d、5 d、7 d组比较差异有统计学意义(P＜0.05),针刺3 d组与针刺7 d组比较差异具有统计学意义(P＜0.05);激光3 d组与针刺3 d组肿胀度比较差异有统计学意义(P＜0.05),提示激光治疗组消炎效果比针刺治疗组作用快。详见表2。

2.2 痛阈测量结果

造模后,模型组痛阈与空白组相比显著降低,且具有统计学意义(P＜0.05),显示造模成功。治疗后,激光组与针刺组痛阈比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。激光3 d组与针刺3 d组的痛阈比治疗前有所提高,且两组痛阈与模型组比较差异具有统计学意义(P＜0.05),且均在治疗第5天出现最低值,治疗第7天有所上升,激光治疗第5天与第7天痛阈相比差异具有统计学意义(P＜0.05),针刺治疗第3天与第5天痛阈相比差异具有统计学意义(P＜0.05),说明激光与针刺治疗均有镇痛消炎作用,但激光治疗显效确比针刺治疗及时。详见表3。

表1 各组大鼠治疗后体重比较(n=10)(±s,g)

表1 各组大鼠治疗后体重比较(n=10)(±s,g)

注:与空白组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05

组别 治疗3 d 治疗5 d 治疗7 d空白组 193.60±10.102) 202.70±11.252) 212.20±11.022)模型组 170.40±9.061) 179.90±10.201) 189.60±10.221)激光组 166.00±16.961) 185.40±12.261) 184.50±10.181)针刺组 162.50±19.611) 178.50±5.641) 184.60±12.671)

表2 各组大鼠治疗后踝关节肿胀度比较 (±s,cm)

表2 各组大鼠治疗后踝关节肿胀度比较 (±s,cm)

注:与空白组比较 1)P＜0.05;与模型组比较 2)P＜0.05;与针刺组比较 3)P＜0.05;与同组治疗 3 d比较 4)P＜0.05;与同组治疗 5 d比较 5)P＜0.05

组别 治疗3 d 治疗5 d 治疗7 d空白组 2.38±0.90 2.38±0.90 2.38±0.90模型组 3.70±0.211) 3.68±0.131) 3.54±0.151)激光组 3.45±0.611)2)3) 3.29±0.141)2)4) 3.07±0.131)2)4)5)针刺组 3.30±0.121)2) 3.21±0.121)2) 3.13±0.121)2)4)

表3 各组大鼠治疗后痛阈比较 (±s,s)

表3 各组大鼠治疗后痛阈比较 (±s,s)

注:与空白组比较 1)P＜0.05;与模型组比较 2)P＜0.05;与针刺组比较 3)P＜0.05;与同组治疗5 d比较4)P＜0.05

组别 治疗3 d 治疗5 d 治疗7 d空白组 8.03±1.54 8.03±1.54 8.03±1.54模型组 5.04±0.541) 4.61±0.831) 5.02±0.761)激光组 7.73±1.471)2)4) 4.86±0.901)3) 5.71±1.561)2)4)针刺组 7.66±1.801)2) 4.80±1.171) 5.60±1.121)4)

2.3 大鼠血清中炎性细胞因子 IL-1、IFN-γ、TNF-α的含量

激光3 d组大鼠血清IL-1含量与模型组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。激光组大鼠IL-1含量整体呈下降趋势,治疗第3天到第5天下降较明显,治疗第7天达到最低值。针刺组第3天到第5天IL-1呈下降趋势,而治疗第5天到第7天却呈明显上升趋势。详见图1、图2。

激光3 d组、针刺3 d组、针刺7 d组大鼠血清IFN-γ含量与空白组和模型组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。激光组 IFN-γ含量呈上升趋势,且治疗第3天到第5天上升较明显,治疗第5天到第7天趋于平缓;针刺治疗第3天到第5天IFN-γ含量呈显著上升,而针刺治疗第5天到第7天IFN-γ含量呈下降趋势,但仍高于针刺3 d组。详见图3、图4。

图1 激光组大鼠血清IL-1含量(ng/mL)

图2 针刺组大鼠血清IL-1含量(ng/mL)

图3 激光组大鼠血清IFN-γ含量(ng/mL)

图4 针刺组大鼠血清IFN-γ含量(ng/mL)

与空白组相比,针刺5 d组和针刺7 d组大鼠血清TNF-α含量具有显著性差异(P＜0.05);与模型组相比,激光3 d组TNF-α含量具有显著性差异(P＜0.05);与激光3 d组相比,针刺3 d组TNF-α含量具有显著性差异(P＜0.05)。激光组大鼠血清TNF-α含量整体呈下降趋势,且治疗第5天到第7天下降趋于平缓。针刺治疗第3天到第5天大鼠血清TNF-α含量呈明显下降趋势,但第5天到第7天TNF-α含量却呈轻微上升趋势(详见图5、图6)。以上均说明半导体激光穴位照射治疗后,相关细胞因子均在治疗第 5天出现转折点,即体现了激光照射治疗具有抛物线特征。而在治疗7 d后,上述指标变化均呈缓慢增长或者下降趋势,体现了随激光照射时长的增加,激光生物效应的累积,显示了其抛物线特性。

图5 激光组大鼠血清TNF-α含量(ng/mL)

图6 针刺组大鼠血清TNF-α含量(ng/mL)

3 讨论

古代医家对各种疼痛性疾病有一定的研究和认识,认为疼痛产生的重要原因是“通则不痛,痛则不通”,如《素问·举痛论》:“寒气入经而稽迟,泣而不行,客于脉外则血少,客于脉中则气不通,故卒然而痛。”《灵枢·五癃精液别》:“髓液皆减而下,下过度则虚,虚故腰背痛而胫酸。”激光穴位照射代替传统的针灸疗法,把激光技术与传统中医理论相结合产生的激光针灸作为行之有效的治疗手段,被称为“21世纪的绿色疗法”[3]。激光针灸具有无痛、无菌、简便、安全、强度可调和适应范围广等特点,是一种符合现代医学发展需要的全新治疗方法[4-8]。本实验通过对 AA大鼠的一般情况、体重、关节肿胀度、痛阈的观察,证明了半导体激光照射和针刺足三里都能使AA大鼠关节红、肿、热等一般症状减轻,改善关节局部炎性组织病理性症状,但是半导体激光照射消炎镇痛作用明显优于针刺疗法,说明半导体激光治疗急性炎性疼痛的疗效更加及时有效。

在炎症发展过程中,病理性疼痛作为一种自觉症状存在其中,可以抑制免疫功能,从而加重炎症本身免疫功能的紊乱[9]。外周组织损伤后,会释放各种炎症因子[10],导致受损神经末梢兴奋或者敏感化,诱发疼痛和痛觉过敏并且维持其发展。其中免疫系统的重要介质细胞因子(cytokines,CKs)介导和调节固有免疫的因子能够识别病毒和细菌,引起细胞因子的分泌;由细胞诱发产生的肿瘤坏死因子(tumor necrosis facor,TNF)、白介素-1(interleukin-1,IL-1)和趋化因子可以征募吞噬细胞到达局部引起全身性应答。本实验研究的细胞因子包括 IL-l、TNF-α、IFN-γ,它们是形成关节炎重要的炎症介质,这些细胞因子相互作用,促进炎细胞聚集活化,介质释放,引起发热,同时下调基质蛋白的合成、刺激基质蛋白酶和环氧合酶等,并各自发挥不同的抗炎作用[11-12],采用半导体激光治疗后,这些炎性指标所反映的机体生物效应累积现象不尽相同,这可能与它们各自的特性有关。

IL-1是一种重要的促炎细胞因子,也是重要的免疫调节分子,主要由单核吞噬细胞产生,由机体炎症、发热急性期蛋白质合成,能诱导其他促炎细胞因子的释放,启动、加强、延长炎症反应,具有致热和介导炎症的作用。Sweitzer等[13]发现SD大鼠脚底注射福尔马林后注射部位的 IL-1β显著增高,脊髓内给予 IL-1抑制剂阻断了福尔马林诱导的伤害行为,显示在疼痛模型中IL-1β能够诱发痛觉过敏。有实验表明IL-l作用于内皮细胞,促进巨噬细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞聚集,从而加重关节炎局部炎症[14]。有学者[15]通过建立SD大鼠佐剂性关节炎(AA)模型实验表明,IL-l明显降低AA大鼠B淋巴细胞增殖和腹腔巨噬细胞IL-1的产生,可恢复T淋巴细胞增殖反应。提示IL-l可明显减轻AA大鼠关节中炎性细胞浸润、滑膜增生、血管翳难成、软骨和骨的破坏。此外,有研究发现,IL-1抗体能有效地抑制小鼠胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)关节软骨和骨的破坏[16]。通过激光治疗能减少血清中IL-1的含量,抑制其他促炎因子的释放,控制炎性反应。

TNF是由单核巨噬细胞产生具有广泛生物学活性的多肽调节因子,在机体的免疫防卫体系中起着十分关键的作用。它包括TNF-α和TNF-β,其中TNF-α与关节炎性疼痛的关系最为密切。TNF-α的作用机制类似于IL-1,因此,TNF-α和IL-1被称为“姐妹细胞因子”,两者的效应及靶细胞的范围有很大相似性。比如TNF-α可以通过刺激滑膜细胞和软骨细胞合成 PGE2和胶原酶,引起软骨与骨的破坏,促进成纤维细胞增生;TNF-α与 IL-1常常又是同时合成分泌的,它们不但以自分泌方式刺激巨噬细胞的增加,而且也能促进彼此的合成。它们在联合应用时能产生很强的协同作用,例如将重组 IL-1注射到大鼠或家兔的关节内能够刺激关节软骨的破坏,与 TNF-α联合注射时,促使软骨破坏的程度远超过单独注射IL-1所引起的效果[17]。通过本实验也发现,激光和针刺足三里均能使大鼠血清中IL-1与TNF-α的含量明显下降,AA大鼠的关节肿胀度明显改善。说明TNF-α和IL-1能相互协调、促进,表现出协同性生物学效应。

IFN-γ又称为免疫干扰素,主要由T和NK细胞产生,它能诱导巨噬细胞、T细胞、B细胞等细胞主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex Ⅰ、Ⅱ,MHC-Ⅰ、Ⅱ)类分子表达,从而提高抗原呈递能力。IFN-γ能够抑制滑膜细胞增殖,减少血管翳形成,抑制破骨细胞活性,减少对关节软骨破坏,下调体液免疫反应。在动物实验中[18],给RA模型小鼠使用抗 IFN-γ的抗体,可使RA缓解;而注射IFN-γ可使RA加剧。临床有人给予人基因重组IFN-γ治疗RA结果表明,IFN-γ对关节肿胀、晨僵改善明显,淋巴细胞转化率由治疗前的异常升高降至正常范围。可见 IFN-γ在关节炎疼痛中发挥重要体内免疫调节作用,因此升高IFN-γ是治疗炎性痛获效环节之一[19]。在激光治疗过程中,我们观察到IFN-γ含量整体呈上升趋势,说明半导体激光照射能够促进 IFN-γ的分泌;同时 IFN-γ自身还能分泌 IL-1、TNF、IFN-α等细胞因子,所以在激光治疗第5天到第7天IL-1、TNF-α的含量降低速度变缓,可能与IFN-γ含量增高呈正相关。

本实验采用的是650 nm半导体激光,为近红外谱段,对生物组织的穿透深度和升温作用均大于 He-Ne激光,它被组织吸收后产生的热能和化学能非常小,不会伤害到组织,却起到了对机体产生刺激调整作用。加上其脉冲输出、光管寿命长、体积小、价格低廉,所以是一种较理想的物理治疗光源,素有人体黄金波段“生命之光”的美称[20]。半导体激光照射AA大鼠足三里3 d后关节肿胀度明显减轻,但7 d后肿胀度减轻程度没有之前明显;3 d治疗后大鼠痛阈依旧是下降趋势,在经过5 d治疗后开始提高;IL-1与TNF-α的含量在治疗3 d到治疗5 d呈下降趋势,治疗5 d到7 d两者的含量虽有下降,但没有之前明显。此外,激光3 d组血清中 IFN-γ含量显著提高,但治疗 5 d到 7 dIFN-γ增量速度明显变缓。这些证实了激光多次小剂量照射和一次大剂量照射所引起的生物效应是一样的,最终效应依赖于激光的总能量。即随着激光照射次数的增加,其刺激量增强,反应强度会出现峰值,再增加刺激次数时,作用强度将明显下降。因此,半导体激光照射消炎镇痛作用在时间上明显优于针刺疗法,说明半导体激光治疗急性炎性疼痛时能缩短疗程。但是它的治疗效果并不是越来越明显,而是趋于平缓,即激光穴位照射存在着一定的累积效应。此外,半导体激光生物效应的累积及其抛物线特性在检测不同的指标时,会呈现不一样的结果,这个与检测指标的特异性以及激光参数和生物特性,例如激光的波长、功率、振动模式和生物体穴位的吸光率、热导率、灵敏度、弛豫时间等密切相关[21]。

本实验选用的是AA大鼠急性关节炎模型,急性炎症主要造成的是局部炎性的改变,而慢性炎症还可能有局部炎部组织发生变性和坏死及全身性不良反应等继发情况。随治疗时间延长,AA大鼠表现的急性炎症反应进入了继发状态,引起全身免疫反应。激光治疗主要起到消炎镇痛的作用,且存在着生物效应的累积,因此半导体激光在治疗急性炎症时效果比较明显,对于慢性炎症的治疗激光疗效可能并不如针刺治疗的疗效,这些还有待下一步研究。

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