菌剂对铬(Ⅵ)污染土壤中坪草幼苗生理生化的影响

高海宁，马国泰，李彩霞，陈勇，宋涛，张勇，4，焦扬，4*

(1.河西学院农业与生物技术学院,甘肃 张掖 734000； 2.兰州大学生命科学学院，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省鹏宇生态环保工程公司,甘肃 兰州 730000；4.甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室,甘肃 张掖 734000)

铬盐是重要的化工原料，广泛应用于电镀、化工、皮革、耐火材料等行业。铬盐生产及其产品应用的各个环节都可能产生含Cr废水。由于Cr(Ⅵ)具有致癌性、致突变性、对生物体具有很强的毒性，被列为国际公认的3种致癌金属物之一[1-2]。我国是铬产品生产和使用大国，因此Cr(Ⅵ)污染治理是一个长期而艰巨的任务。我国人口压力大，耕地资源紧张，安全有效地修复重金属污染土壤，既可实现土地资源的再利用，同时，又可避免重金属通过食物链迁移。相对于Cr(Ⅵ)，Cr(Ⅲ)毒性较低，对环境影响较小，因此土壤Cr(Ⅵ)污染的修复机制通常有两种[3-4]：一是改变Cr在土壤中的存在形态，将Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)，降低其在环境中的迁移能力和生物可利用性；二是将Cr从被污染土壤中清除。

Cr(Ⅵ)污染土壤的微生物修复是利用土壤中的土著微生物或经驯化的特定微生物，通过将Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)，达到降低Cr的移动性和毒性等目的[5]。铬渣堆场铬污染土壤中土著微生物对Cr(Ⅵ)具有很强的还原能力，直接向土壤中添加营养物质可刺激土著微生物活性，将Cr污染土壤中Cr(Ⅵ)还原成Cr(Ⅲ)进行Cr污染土壤的微生物修复[6]。但从机理上，微生物不利于收集或富集重金属，因而，单独应用微生物修复金属污染土壤受到限制[7]。通过耐Cr植物对Cr污染场地的绿化与覆盖，控制Cr向深层土壤移动是控制Cr(Ⅵ)污染的重要措施[8]。孟庆恒等[9]筛选出4株对Cr(Ⅵ)的清除率大于50%的土著菌株，并与玉米(Zeamays)幼苗组合进行微生物-植物联合修复，具有明显降低培养液中Cr(Ⅵ)浓度的效果，因此，研究微生物对重金属污染修复具有重要的现实意义。

高羊茅(Festucaarundinacea)和黑麦草(Loldiumperenne)是两种常见的多年生冷季型草坪草，也是温带地区重要的禾草类牧草。发现高羊茅和黑麦草具有吸收不同重金属的能力，杨卓等[10]对两种坪草富集Zn、Cd、Pb的能力进行了研究，发现两种坪草对Zn污染土壤的修复能力较强；张蕾等[11]通过盆栽试验，研究黑麦草对复合污染河道浚底泥的修复效果，结果表明，黑麦草对Zn、Cd、Cu的富集能力强，是修复重金属-有机复合物的良好植物；赵树兰和多立安[12]研究Cu2+与Zn2+对高羊茅生长的影响，结果显示高羊茅根系和茎叶具有富集重金属的能力；Zhu等[13]研究尾矿污染土壤对高羊茅和早熟禾(Poaannua)生长的影响，发现这些坪草对重金属具有吸耐能力。以上研究主要集中在坪草对重金属污染土壤的修复等方面，或者研究对象单一，并未涉及菌剂对铬(Ⅵ)污染土壤中坪草幼苗生理方面的相关报道。

本研究以高羊茅和黑麦草为材料，以Cr(Ⅵ)污染土壤为基质，以期检测菌剂处理对Cr(Ⅵ)污染土壤中高羊茅和黑麦草幼苗生理生化特性的影响，拟为Cr污染场地的微生物-植物联合治理提供技术与理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1菌剂 从张掖周边盐碱化和Cr污染土壤中筛选到革兰氏阴性芽孢杆菌Rs-2和K1，革兰氏阳性芽孢菌Rs-4。3株菌具有在盐碱环境中溶磷、硅的特性[14]，且Rs-2、K1菌株可将Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)。将菌株发酵得到高密度菌液，以Rs-2∶Rs-4∶K1=9∶6∶4比例得到混合菌液，加入1.5%的载体材料和0.1%的甘油，制备得到复合菌剂，以培养基代替菌液再加入1.5%的载体材料和0.1%的甘油作为对照。

1.1.2供试土壤与植物 Cr(Ⅵ)污染土壤采自甘肃省张掖市民乐县富源化工有限公司污水口周边。Cr(Ⅵ)污染土壤采回后锤碎，挑除石子，备用。供试植物为高羊茅和黑麦草。

1.2 实验方法

1.2.1培养基 菌液发酵培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，NaCl 5.0，MgSO40.2，pH自然。

1.2.2实验设计 实验于2012年3-7月在河西学院植物生理实验室进行。供试土壤按80∶10∶1的比例将Cr(Ⅵ)污染土壤∶有机肥(羊粪与玉米芯堆肥)∶菌剂混合均匀，加适量水后密封，每天搅拌一次，7 d后土壤处理完成。将处理后的Cr(Ⅵ)污染土壤均匀装入育苗盘中。每穴播种经30% H2O2表面杀菌种子20粒，然后覆盖1 cm左右处理过的土壤，浇透水至育苗盘底渗出水为止，每个处理重复3个育苗盘(4×9=36孔)，每天进行管理，使土壤保持湿润，待两种坪草出芽后对植株进行间苗，每钵保留10株。当植物幼苗生长至3叶龄时，对照组(CK)浇灌稀释5倍的对照液，处理组浇灌稀释5倍的菌剂，在植物幼苗处理6 d后，测定幼苗生理指标，每项指标做3组平行。

1.3 分析方法

1.3.1土壤指标测定方法 土壤pH值的测定采用酸度计法；可溶性盐的测定采用质量法；土壤Cr(Ⅵ)含量的测定采用二苯碳酰二肼比色法[15]。

1.3.2生化指标测定方法 称取植物叶片0.2 g，加入50 mmol/L pH 7.8的磷酸缓冲液研磨，4℃、10000 r/min离心10 min，上清液定容至5 mL，得粗酶液备用。POD(peroxidase，过氧化物酶)活性测定采用愈创木酚法；SOD(superoxide dismutase，超氧化物歧化酶)活性测定采用氮蓝四唑光还原法；CAT(catalase，过氧化氢酶)活性测定采用紫外分光光度法；叶绿素含量测定采用分光光度法；脯氨酸含量测定采用酸性茚三酮比色法；细胞膜透性测定采用电导法；丙二醛(MDA)的测定采用2-硫代巴比妥酸法；植物组织根部、地上部分Cr含量测定采用火焰原子吸收分光光度法[16]。

根据植物根、叶组织Cr的含量计算生物富集系数：生物富集系数=坪草铬含量(mg/kg DW)/土壤铬含量(mg/kg)。

1.4 数据处理

每个处理做3次重复，以平均值±标准偏差表示各指标的大小，采用SSR法检验差异显著性。Origin Lab 7.5软件进行数据作图。

2 结果与分析

2.1 供试土壤处理前后的变化

由表1可见，供试土壤被菌剂处理后，其pH从7.38增长为8.25，而可溶性盐和Cr(Ⅵ)分别从6.20%和53.9 mg/kg降为5.25%和23.6 mg/kg，

表1 供试土壤处理前后的指标变化

注：采用Duncan’s multiple range test 方法分析，同列不同字母表示显著性差异(P<0.05，n=3)，下同。Note: Analysis using Duncan’s multiple range test method, the different letters in the same column show significant difference (P<0.05,n=3), the same below.且供试土壤被菌剂处理前后Cr(Ⅵ)的变化差异显著。

2.2 菌剂对坪草幼苗根和地上部分Cr含量的影响

由表2可知，污染土壤中Cr被坪草吸收后，大部分停留在根部，少量向地上部分迁移。CK组较处理组叶和根中的Cr含量差异均显著。CK组坪草叶中Cr含量为根中Cr含量的11%～14%；而处理组叶中Cr含量为根中Cr含量的31%～39%。由生物富集系数可见，CK组两种坪草叶Cr的生物富集系数为0.62和0.50，而处理组的生物富集系数增大至1.10和1.05，由此，处理前后根中Cr含量在降低，而叶中Cr含量在增加。且两坪草根和叶对Cr的富集有差异，其中高羊茅对Cr富集略高于黑麦草，但差异不显著。

表2 坪草幼苗根系、地上部分铬的含量

2.3 菌剂对坪草幼苗叶绿素含量的影响

图1 Cr(Ⅵ)污染土壤中坪草幼苗叶绿素含量

从图1可见，CK组两坪草幼苗叶绿素的含量是1.44和1.68 mg/g FW，经菌剂处理后，高羊茅和黑麦草幼苗总叶绿素含量增加至2.19和1.98 mg/g FW。两坪草处理组叶绿素含量均高于CK组，而且高羊茅的这种变化差异显著，可见，在坪草幼苗生长过程中辅以菌剂处理，可使幼苗叶绿素含量增加。

2.4 菌剂处理对坪草幼苗保护酶系的影响

由表3可见，菌剂处理后，高羊茅和黑麦草的SOD和CAT都高于CK组，处理组是CK组的1.13，1.47倍和1.19，1.04倍，但处理组较CK组，两坪草的POD、CAT以及高羊茅的SOD差异均不显著，而黑麦草的SOD处理前后差异显著。加菌剂处理后，高羊茅的POD活性较CK组降低，处理组是CK的0.85倍。

2.5 菌剂处理对坪草幼苗脯氨酸、丙二醛和相对电导率的影响

由表4可知，处理组较CK组，黑麦草的MDA、脯氨酸和相对电导率均有一定程度的降低，且差异显著。高羊茅的处理组较CK组，脯氨酸变化差异显著，虽MDA和相对电导率有一定程度降低，但差异不显著。由此，经菌剂处理后两坪草的脯氨酸含量降低较明显，黑麦草的MDA和相对电导率较高羊茅的降低更为显著。

表3 菌剂对Cr(Ⅵ)污染土壤坪草幼苗细胞保护酶活性的影响

表4 菌剂对Cr(Ⅵ)污染土壤坪草幼苗脯氨酸、丙二醛和相对电导率的影响

3 讨论

常文越等[2]在25℃、投加2%的还原菌，在施用菌剂1个月后，土壤浸出液Cr(Ⅵ)浓度范围从10～55 mg/L降低至0.75 mg/L以下。在实验中对供试土壤采用菌剂处理后，污染土壤中Cr(Ⅵ)的浓度从53.9 mg/kg降为23.6 mg/kg，且土壤pH略升而含盐量略降，可能是菌剂的还原作用降低了Cr(Ⅵ)在污染土壤中的含量，因此，菌剂对Cr(Ⅵ)污染土壤具有一定的改良效果。

重金属元素能否向植物地上部分，特别是向叶片部分的迁移是判断超积累植物的重要标准之一[17]。重金属在植物体内的积累有很大的差异，不同植物对重金属的策略也不一致，有的采用富集策略，也有的采用排斥策略[18]。Zayed等[1]研究发现，在使用Cr(Ⅵ)培养液后，供试作物根中含量为160～350 mg/kg DW，茎中含量为1.6～2.0 mg/kg DW，即重金属Cr在植物体内新陈代谢旺盛的器官中蓄积量较大[9]。实验中，当供试植物在Cr(Ⅵ)污染土壤中生长时，在幼苗期辅以菌剂处理，Cr在高羊茅和黑麦草根中的积累从103.51和102.96 mg/kg降为81.55和62.91 mg/kg，但两种坪草叶对Cr的生物富集系数从0.62和0.50增长为1.10和1.05。由此可得，菌剂处理对缓解Cr在新陈代谢旺盛的器官中的蓄积有明显效果，而且可以提高Cr在坪草地上部分，尤其是叶中的生物富集量。

叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，它受重金属的影响比较明显。王爱云和黄珊珊[19]以外源Cr(Ⅵ)浓度在0～300 mg/kg范围内模拟Cr污染土壤，高羊茅幼苗总叶绿素含量从3.43 mg/g降为2.81 mg/g。本实验中菌剂处理后，高羊茅幼苗叶中总叶绿素含量从1.44 mg/g FW增加至2.19 mg/g FW，叶绿素总量低于报道值的3.43 mg/g，可能源于Cr(Ⅵ)污染土壤成分更为复杂，且有5.25%的盐含量，但菌剂处理后将幼苗叶绿素总量提高了52.1%。因此，幼苗期辅以菌剂处理可以缓解坪草在Cr(Ⅵ)胁迫条件下幼苗叶绿素的降低程度，但不同坪草提高幅度有差异。

POD、SOD和CAT是植物体内酶促防御系统的3个重要保护酶，当植物处于逆境条件下，POD、SOD、CAT保护酶通过协调作用能有效清除OH-，O2-等自由基，防御膜脂过氧化，使植物细胞膜免受伤害。SOD和CAT活性的同时提高十分重要，由于SOD在清除自由基时，同时生成H2O2自由基，它可以通过Fenton型Haber-Weiss反应生成更多的自由基，CAT活性提高能与SOD协同作用更好地保护细胞膜免受自由基的伤害[20]。本研究结果表明，菌剂处理后，高羊茅和黑麦草的SOD和CAT活性都高于CK组，处理组是CK的1.13，1.47倍和1.19，1.04倍，表明在植物幼苗期辅以菌剂处理，可增加高羊茅和黑麦草的SOD和CAT活性来清除由Cr而引起的氧化伤害，与高羊茅相比较，黑麦草SOD活性增幅更高。

孙健等[21]报道重金属胁迫能诱导植物组织中POD总活性升高，这是对所有污染胁迫的共同响应。POD利用H2O2来催化对自身有害过氧化物的氧化和分解[22]；许长成等[23]报道大豆(Glycinemax)在干旱条件下，大豆叶片H2O2含量增加，CAT活性降低，POD活性随着升高，由此POD活性的变化与干旱条件的H2O2有关。本研究发现在Cr处理下，菌剂对高羊茅的POD活性的影响有所不同，高羊茅在不加菌剂时，其叶片中POD活性达到了485.6 U/g FW，而加菌剂后使高羊茅POD活性下降，但是CAT活性增加，推测Cr(Ⅵ)污染土壤高羊茅幼苗体内CAT活性强于POD，H2O2的积累量减少，从而使POD活性出现下降。而黑麦草加入菌剂后POD、CAT、SOD活性均高于CK组，三者酶协同作用，降低Cr的氧化损伤，使得MDA含量和相对电导率显著低于对照组，保护了膜的完整性，但相比较而言，高羊茅幼苗体内MDA含量和相对电导率降低幅度较小。

脯氨酸在植物渗透调节中起着重要的作用。脯氨酸的合成、累积及代谢是一个受非生物胁迫和细胞内脯氨酸浓度调控的生理生化过程[24-25]。脯氨酸含量升高，是植物受到重金属毒害的一个重要特征。张小艾等[26]认为，对于脯氨酸含量在逆境下增加是一种伤害反应的观点不一，其机理有待进一步研究。本实验中，CK组的Cr(Ⅵ)污染土壤中两种坪草脯氨酸含量显著高于菌剂处理组，说明在Cr胁迫下脯氨酸含量的升高是维持细胞渗透势，对植物细胞具有保护作用，辅以菌剂后脯氨酸含量降低，而保护酶活性升高，MDA和细胞电导率的处理组/CK均小于1，降低了Cr(Ⅵ)污染土壤对黑麦草和高羊茅幼苗细胞膜不饱和脂肪酸的破坏程度和氧化损伤，减缓了Cr(Ⅵ)对两种坪草的毒害作用[27]。

4 结论

在坪草幼苗期辅以菌剂处理，对缓解Cr在新陈代谢旺盛器官中的蓄积有明显效果，而且可以提高Cr在坪草地上部分，尤其是叶中的生物富集量；并能够降低Cr(Ⅵ)污染土壤坪草幼苗的质膜透性和MDA含量，提高POD、SOD和CAT保护酶活性。采用菌剂处理Cr(Ⅵ)污染土壤，可降低Cr(Ⅵ)污染土壤中Cr(Ⅵ)的含量，对Cr(Ⅵ)污染土壤具有一定的修复和改良效果。