添加糖蜜和乳酸菌制剂对西藏青稞秸秆和多年生黑麦草混合青贮发酵品质的影响

赵庆杰，原现军，郭刚，闻爱友，巴桑，王奇，沈振西，余成群，邵涛＊

（1.南京农业大学动物科学技术学院饲草调制加工与贮藏研究所，江苏 南京210095；2.中国科学院地理科学与资源研究所，北京100101；3.西藏日喀则地区草原工作站，西藏 日喀则857000；4.海南大学应用科技学院儋州校区，海南 儋州571737）

西藏由于特殊的地理位置和生态条件，草地生态系统极为脆弱，抗干扰能力很低，植被一旦遭到破坏恢复困难，畜牧业难以可持续发展。近年来，西藏地区随着人口的增加和畜牧业的发展，单纯依赖天然草地已经不能满足家畜对饲草料的需求。因此，在西藏“一江两河”农区开展优质牧草的种植、加工贮藏，解决冬春季牧区饲草料短缺问题，不但可以缓解家畜增多对天然草地造成的压力，使草地生态功能得以恢复，同时也能促进畜牧业生产效率的提高。

西藏日喀则地区以“世界青稞之乡”著称，是第一大粮食作物，青稞（Hordeumvulgare）秸秆资源较丰富，但其水溶性碳水化合物含量低、粗纤维含量高、质地粗硬，直接利用适口性差、可消化养分低，单独青贮也较难获得成功。多年生黑麦草（Loliumperenne）生长速度快，再生能力强，营养丰富，适口性好，在日喀则地区也有一定的种植面积；将青稞秸秆与多年生黑麦草混合青贮，既可以克服青稞秸秆单独青贮发酵品质差及营养价值低的缺点，又可以解决在西藏地区单纯利用牧草开展青贮饲料生产所带来的青贮原料不足的问题。

优质青贮饲料调制所必备的条件是严格的厌氧条件、原料中充足的乳酸菌数量和活性及足够的发酵底物，因此添加乳酸菌制剂和糖蜜是改善青贮发酵品质的有效措施。蔡义民等［1］以意大利黑麦草（Loliummultiflorum）为材料，添加2种乳酸球菌和1种乳酸杆菌进行青贮饲料调制，结果表明添加乳酸菌可以提高乳酸含量，降低pH，有效抑制了霉菌、酵母菌等有害微生物的繁殖。Kung等［2］研究发现接种乳酸菌的玉米（Zeamays）青贮饲料中乳酸、乙酸含量均有提高，但其他成分变化较小。张静等［3］在多花黑麦草青贮中添加乳酸菌制剂显著提高了青贮饲料的乳酸含量，降低了pH。Weinberg等［4］为了将橄榄饼用作反刍动物饲料，将其青贮并添加糖蜜发现，糖蜜添加组乳酸含量和乳酸菌数量均显著提高。Hashemzadeh－Cigari等［5］对苜蓿（Medicagosativa）青贮时添加糖蜜，并接种乳酸菌，发现组合添加对青贮饲料发酵品质的改善效果优于糖蜜单独添加。

本研究旨在根据前期青稞秸秆与多年生黑麦草混合青贮比例筛选研究结果［6］，进一步添加乳酸菌制剂和糖蜜探讨其对青稞秸秆与多年生黑麦草混合青贮发酵品质的影响，确定改善混合青贮发酵品质的措施。

1 材料与方法

1.1 试验材料

将种植于西藏日喀则地区草原工作站试验地的青稞和多年生黑麦草于2012年8月24日刈割，青稞秸秆为去除籽粒后的茎杆，多年生黑麦草刈割时处于抽穗初期。青稞秸秆和多年生黑麦草主要化学成分见表1。

乳酸菌制剂由南京农业大学动物科技学院饲草调制加工与贮藏研究所和西藏高原草业工程技术研究中心共同研制，主要由植物乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌以及葡萄糖等组成；糖蜜为制糖副产品，主要成分为蔗糖，红褐色粘稠液体。

实验室青贮窖采用容积为2L的塑料容器。

表1 青稞秸秆和多年生黑麦草主要化学成分Table 1 Chemical compositions of hullessbarley straw and perennial ryegrass

1.2 试验设计

试验采用完全随机区组设计，设对照组（Control）、乳酸菌制剂组（LAB，2g/kg鲜重）、糖蜜组（M，40g/kg鲜重）、乳酸菌制剂＋糖蜜组（LAB＋M）4个处理组。每个处理各时间点6个重复，在青贮后的第7，24和45天打开青贮容器，取样分析各项指标。

1.3 试验方法

各青贮原料用铡刀切成2cm左右后，将青稞秸秆和多年生黑麦草以4∶6的鲜重比充分混匀，并按试验设计量添加糖蜜和乳酸菌制剂，再次充分混合均匀。装填至2L的实验室青贮窖中，压实后盖上内外盖，并用胶带密封，置于室温下保存。

在青贮后第7，24和45天分别打开青贮窖，取出全部样品充分混合均匀，按“四分法”称取35g样品，放入100mL三角瓶中，加入70g去离子水，置于4℃冰箱内浸提24h，然后通过2层纱布和定性滤纸，所得液体为青贮饲料浸提液，置于－20℃冷冻冰箱保存待测。浸提液用来测定pH、乳酸、氨态氮和挥发性脂肪酸。将剩余部分青贮饲料收集烘干粉碎，测定干物质、总氮以及水溶性碳水化合物。其中总氮含量采用凯氏定氮法测定［7］，水溶性碳水化合物含量采用蒽酮硫酸比色法测定［8］。

原料草和青贮饲料在65℃条件下烘60h以上至恒重，测定干物质含量（dry matter，DM）；pH使用HANNA pH211型pH 计测定；乳酸（lactic acid，LA）含量采用对羟基联苯比色法测定［9］；氨态氮（ammonia nitrogen，AN）含量采用苯酚－次氯酸钠比色法测定［10］。挥发性脂肪酸（total volatile fatty acids）包括乙酸（acetic acid，AA）、丙酸（propionic acid，PA）和丁酸（butyric acid，BA）采用高效气相色谱仪（日本岛津 GC－14B型，色谱柱为30m×0.25mm×0.25μm毛细管柱）测定，条件为：柱温140℃，汽化室温度180℃，氢气检测器温度220℃，检测器FID，载气为氮气，压力为0.05MPa，氢气压力为0.05MPa，氧气压力为0.05MPa。

1.4 数据统计

采用SAS（9.2）软件对试验数据进行单因子方差分析（ANOVA），并用Duncan方法对处理间及青贮天数间数据进行多重比较（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 添加乳酸菌制剂和糖蜜对青稞秸秆与多年生黑麦草混合青贮过程中pH、干物质和乳酸含量的影响

由表2可见，随着青贮的进行各组干物质含量无明显（P＞0.05）变化。整个青贮过程中，M和LAB＋M组干物质含量始终显著（P＜0.05）高于对照组和LAB组，LAB组干物质含量在青贮前24d显著（P＜0.05）高于对照组，之后逐渐降至与对照组相同的水平（P＞0.05）。

青贮第7天M和LAB＋M组乳酸含量显著（P＜0.05）高于对照组和LAB处理组，之后对照组和LAB组乳酸含量显著（P＜0.05）上升，至青贮第24天与 M和LAB＋M组基本持平（P＞0.05），此后趋于稳定，而 M和LAB＋M组乳酸含量继续上升，到青贮第45天又显著（P＜0.05）高于对照组。相应地，pH呈现与乳酸含量相反的变化趋势，在青贮第7天各添加剂处理组pH显著（P＜0.05）低于对照组，其中M和LAB＋M组显著（P＜0.05）低于LAB处理组，之后各组基本趋于稳定，在青贮结束时各添加剂处理组pH均低于对照组，其中LAB＋M组pH最低，显著低于对照组（P＜0.05）。

表2 添加乳酸菌制剂和糖蜜对青稞秸秆与多年生黑麦草混合青贮过程中pH值、干物质和乳酸含量的影响Table 2 Effect of adding lactobacillus and molasses on pH，DM and LA contents of mixed silages of hullessbarley straw and perennial ryegrass during ensiling

2.2 添加乳酸菌制剂和糖蜜对青稞秸秆与多年生黑麦草混合青贮过程中挥发性脂肪酸含量的影响

由表3可见，随着青贮的进行，各组乙酸含量均呈逐渐上升趋势，其中LAB组24d后乙酸含量显著（P＜0.05）上升。整个青贮过程中LAB组始终显示最低的乙酸含量。随着青贮的进行，各组挥发性脂肪酸不断积累，呈现与乙酸相似的变化趋势。

各组丙酸和丁酸含量随着发酵的进行呈上升趋势，其中青贮45d各添加组丙酸含量均低于对照组，但差异不显著（P＞0.05）。整个青贮过程中LAB组呈现最高的丁酸含量，其中第24和45天显著（P＜0.05）高于其他各组。

在整个青贮过程中，LA/AA值随着乳酸和乙酸的变化，呈现不同的变化趋势，但各添加组LA/AA值始终高于（P＞0.05）或显著（P＜0.05）高于对照组。

表3 添加乳酸菌制剂和糖蜜对青稞秸秆与多年生黑麦草混合青贮过程中挥发性脂肪酸含量的影响Table 3 Effect of adding lactobacillus and molasses on volatile fatty acid contents of mixed silages of hullessbarley straw and perennial ryegrass during ensiling

2.3 添加乳酸菌制剂和糖蜜对青稞秸秆与多年生黑麦草混合青贮过程中氨态氮/总氮和水溶性碳水化合物含量的影响

青贮第7天LAB组AN/TN值显著（P＜0.05）高于其他各组（表4），之后各组虽略有波动但总体保持稳定，其中LAB组AN/TN值始终保持最高值，至青贮结束时仍显著（P＜0.05）高于其他各组，而其他各组间无显著（P＞0.05）差异。

随着青贮时间的延长，各组水溶性碳水化合物含量逐渐下降。在青贮第7天M和LAB＋M组水溶性碳水化合物含量高于LAB组和对照组，但差异不显著（P＞0.05），之后各组水溶性碳水化合物含量显著（P＜0.05）下降，在青贮第24天M和LAB＋M组水溶性碳水化合物含量开始显著（P＜0.05）高于LAB组和对照组，并且一直保持到青贮结束。

3 讨论

本试验采用塑料容器模拟生产青贮窖，快速装填，且密封良好，无流汁损失［11］，因此整个青贮过程中干物质含量无明显变化。青贮60d后对照组和LAB组干物质含量显著低于M和LAB＋M组，这可能是由于整个青贮过程中对照组和LAB组pH始终较高，未能有效抑制有害微生物活性，造成营养成分损失，从而导致干物质含量下降［12］。

青贮第7天，乳酸菌制剂处理组乳酸含量显著（P＜0.05）高于对照组，pH显著（P＜0.05）低于对照组，这是由于添加乳酸菌制剂增加了乳酸菌数量，促使青贮初期（7d）乳酸快速产生，进而使pH快速下降。Gao等［13］将植物乳杆菌（Lactobacillaceaeplantarum）、发酵乳杆菌（Lactobacillaceaefermentum）和副干酪乳杆菌（Lactobacillaceaeparacasei）混合物接种到水稻（Oryzasativa）秸秆中进行青贮，发现显著改善了青贮发酵品质，提高了乳酸含量，降低了pH。青贮第7天糖蜜添加组乳酸含量显著高于对照组，pH已降至4.07，显著低于对照组的4.85，这是由于糖蜜富含水溶性碳水化合物，可为乳酸菌提供较为充足的发酵底物，促使乳酸菌快速繁殖并占主导地位，乳酸快速生成，pH迅速下降［14－15］。这与Aksu等［16］研究结果一致，Aksu等［16］在玉米青贮时添加糖蜜，显著提高了青贮饲料的乳酸含量。糖蜜和乳酸菌制剂组合添加组发酵品质与糖蜜单独添加组发酵品质相近，无显著差异，但与乳酸菌制剂单独添加组相比，进一步提高了乳酸含量，降低了pH，同时本试验中糖蜜单独添加组发酵品质优于乳酸菌单独添加组，由此表明水溶性碳水化合物缺乏对青稞秸秆和多年生黑麦草混合青贮发酵品质的限制作用大于乳酸菌。Seale等［17］也指出影响青贮饲料发酵品质的因素很多，其中青贮材料水溶性碳水化合物含量是影响青贮发酵品质的主要因素之一。

表4 添加乳酸菌制剂和糖蜜对青稞秸秆与多年生黑麦草混合青贮过程中氨态氮/总氮和水溶性碳水化合物含量的影响Table 4 Effect of adding lactobacillus and molasses on WSC content and AN/TN of mixed silages of hullessbarley straw and perennial ryegrass during ensiling

青贮饲料中乙酸一部分是由发酵初期乙酸菌等好氧性微生物代谢产生，随着青贮时间的延长，异质型乳酸菌逐渐占主导，也会产生部分乙酸。本试验中，各组乙酸大部分产生于青贮前7d，随着青贮的进行乙酸含量也逐渐增加，可能是青贮后期，异质型乳酸菌逐渐活跃所致。本试验添加糖蜜提高了乙酸含量，表明糖蜜不仅促进了青贮早期同型乳酸发酵，同时也为异质型乳酸菌提供了发酵底物，因此产生了较高的乙酸含量。本试验结果显示乳酸菌单独添加组乙酸含量低于对照组，乳酸/乙酸值显著高于对照组，这是由于本试验所使用的乳酸菌制剂主要以植物乳杆菌为主，而植物乳杆菌是同质型乳酸菌，与发酵过程中异质型乳酸菌竞争发酵底物，从而减少乙酸的生成。

研究表明丙酸菌活性在pH低于4.8时已被抑制［18－19］，本试验中仅对照组在青贮第7天pH高于4.8，因此各组仅检测到微量丙酸，其中对照组最高达到1.08g/kg DM。丁酸主要由丁酸菌代谢产生，并且伴随着较高的pH和蛋白质的降解［20］，本试验中乳酸菌制剂添加组第45天丁酸含量显著高于对照组，表明青贮后期由于pH较高，未能完全有效地抑制有害微生物活性，尤其是丁酸菌的繁殖。

氨态氮/总氮值能够反映青贮过程中蛋白质和氨基酸的降解程度，一般认为常规优质青贮饲料的氨态氮/总氮应小于100g/kg TN［21］，本试验中各组氨态氮/总氮均小于此值，但乳酸菌制剂处理组显著高于其他各组，这与乳酸菌制剂组有较高的丁酸含量是一致的，因此表明氨态氮和丁酸的生成可能是梭菌活跃的产物。Bergen等［22］研究表明，梭菌主要有2种类型分别是蛋白降解型梭菌和糖降解型梭菌，其中糖降解型梭菌主要代谢水溶性碳水化合物产生丁酸，而蛋白降解型梭菌在生成丁酸的同时，也降解蛋白质和氨基酸，生成氨态氮。本试验中乳酸菌制剂添加组丁酸和氨态氮/总氮均高于其他各组，可能是由于梭菌活跃所致。Kwak等［23］关于平菇菌糠饲料化研究中，通过添加糖蜜和接种植物乳杆菌改善青贮发酵品质，发现接种乳酸菌组氨态氮/总氮高于对照组，本试验结论与此一致。

添加糖蜜直接补充了发酵底物，使得糖蜜处理组（包括单独添加和组合添加）残留水溶性碳水化合物含量高于对照。而乳酸菌制剂增加了乳酸菌数量，消耗了更多的发酵底物产生乳酸，因此显示较低的水溶性碳水化合物含量。

4 结论

综上所述，添加乳酸菌制剂直接增加了乳酸菌数量，提高了青贮早期乳酸发酵速度，但青贮后期，由于糖分不足，pH有所上升，未能抑制有害微生物的活性，使得丁酸和氨态氮含量有所提高。添加糖蜜增加了乳酸菌发酵底物，促进了乳酸发酵，降低了pH，从而抑制了有害微生物的繁殖，提高了青贮发酵品质。组合添加乳酸菌制剂和糖蜜与单独添加乳酸菌制剂相比显著提高了青贮发酵品质，但与单独添加糖蜜相比差异不显著，表明水溶性碳水化合物不足是限制青稞秸秆与多年生黑麦草混合青贮发酵的主要因素。

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