人着色性干皮病基因D对HepG2细胞Mdm2和Mdm4表达的影响*

丁 浩， 张吉翔

(南昌大学第二附属医院消化内科，江西南昌330006)

人鼠双微体2(murine double minute 2，Mdm2)和鼠双微体4(murine double minute 4，Mdm4)是属于同一家族且进化保守的原癌蛋白，在序列上与小鼠有着较高的同源性。两者在一级结构上具有同源性，特别是在P53蛋白结合域更是如此，因此Mdm2和Mdm4均能与P53蛋白相结合;并且，Mdm2羧基末端的金属结合域在Mdm4分子中亦是高度保守的［1］。Mdm2能使得P53的抑癌活性丧失，抑制其抗肿瘤活性，进而促进肿瘤的形成［2］。人剪切修复基因着色性干皮病基因D(xeroderma pigmentosum D，XPD)是转录因子ⅡH(transcription factorⅡH，TFⅡH)的一个组分［3］。大量研究发现，XPD除了在TFⅡH介导的核苷酸切除修复和转录过程中发挥主要作用外，还参与了细胞的增殖和凋亡，并能起到抑癌基因的作用［4-5］。因此我们假设XPD能下调Mdm2和Mdm4的表达。为此，本研究用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD转染进入人肝癌细胞株以使得XPD高表达，然后检测Mdm2、Mdm4和P53表达量的变化，并观察肝癌细胞的增殖和凋亡。

材料和方法

1 材料

人肝癌细胞株HepG2购自美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection，ATCC);培养基DMEM购自HyClone;胎牛血清购自Gibco;重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2由本实验室构建并保存，pEGFP-N2/XPD已通过PCR反应、酶切及基因测序三重鉴定［6］。LipofectamineTM2000和Trizol购自Invitrogen;MTT购自Solarbio;DMSO购自Amresco;逆转录试剂盒购自 Fermentas;引物由Generay Biotech合成;2×Taq PCR MasterMix购自天根生物技术有限公司;总蛋白提取试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司;Ⅰ抗XPD、Mdm2、Mdm4、P53和β-actin购自Santa Cruz;Ⅱ抗辣根过氧化物酶IgG购自北京中杉金桥公司。

2 方法

2.1 细胞培养和质粒的转染 将HepG2细胞置于含10%胎牛血清和双抗(1×105U/L的青霉素和100 mg/L的链霉素)的DMEM培养基的培养瓶中，37℃、饱和空气湿度和5%的CO2培养箱内培养。以1×105cells/well的密度将细胞铺于6孔板内，24 h后细胞融合率约为90%。用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2转染细胞，质粒每孔4.0 μg，脂质体每孔10 μL介导转染。实验分为空白对照组、pEGFP-N2组和pEGFP-N2/XPD组。转染48 h后收获细胞。

2.2 MTT检测细胞增殖活力 将细胞种植在96孔板中，空白调零孔只加不含细胞的培养基。实验处理后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，继续培养4 h，弃上清，加入 150 μL DMSO，振荡 15 min，酶标仪(Labsystems)测定492 nm处各孔吸光度(A)。

2.3 流式细胞术检测细胞周期和凋亡率 用胰酶消化收集上述各组细胞，采用碘化丙啶(propidium iodide，PI)单染法，应用 FACSCalibar流式细胞仪(Beckton Dickinson)分析细胞周期，得出细胞各周期的百分率。流式细胞术检测细胞凋亡率按试剂说明书进行，主要步骤为:用胰酶消化收集细胞，PBS洗涤细胞2次，再用500 μL的 binding buffer悬浮细胞，分别加入Annexin V-FITC和 PI各5 μL，最后用流式细胞仪检测。

2.4 RT-PCR检测mRNA表达水平 细胞总RNA抽提和逆转录参照试剂说明书进行操作。XPD上游引物为 5′-TCTGCCTCTGCCCTATGAT-3′，下游引物为5′-CGATTCCCTCGGACACTTT-3′，产 物 大 小 为 363 bp;Mdm2上游引物为 5′-ACCGAGTCTTGCTCTGTTAC-3′，下 游 引 物 为 5′-GGTGTGGTGGCAGATGAC-3′，产物大小为 139 bp;Mdm4 上游引物为 5′-GATGATACCGATGTAGAGG-3′，下游引物 5′-TCAGAACTGTGAGCCAAA-3′，产物大小为332 bp;P53上游引物为 5′-CTACAAGCAGTCACAGCACATGAC-3′，下游引物为 5’-TCATTCAGCTCTCGGAACATCTCG-3′，产物大小为 551 bp;β-actin上游引物为 5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游 引物 为 5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，产物大小为 434 bp。PCR 反应体系如下:cDNA 500 ng，上、下游引物各 1 μL，2 ×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，补去离子水至终体积25 μL。按下列条件进行扩增:预变性，1个循环，94℃ 5 min;PCR反应，94℃ 40 s，58℃ 40 s，72℃ 55 s，35个循环，72 ℃ 7 min。取 5 μL PCR 产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，用暗箱式紫外透射仪观察电泳结果并拍照。结果用Band Leader 3.0软件，以目的条带/β-actin的吸光度比值进行分析。

2.5 Western blotting法检测蛋白表达水平 用RIPA法取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，取100 μg进行SDS-PAGE分离蛋白。蛋白转印到硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉溶液4℃封闭过夜。膜分别用按相应比例稀释的 XPD、Mdm2、Mdm4和 β-actin的Ⅰ抗孵育，4℃过夜，Ⅱ抗孵育2 h，DAB显色照相。结果用Quantity One 4.62软件，以目的条带/β-actin的灰度比值进行分析。

3 统计学处理

实验均重复6次。应用统计学软件SPSS 13.0分析，数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 pEGFP-N2/XPD转染对HepG2细胞增殖活力的影响

MTT结果显示，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的A值明显低于空白对照组和空载质粒pEGFPN2组(P＜0.01);而空白对照组与转染空载质粒pEGFP-N2组之间相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表 1。

表1 pEGFP-N2/XPD转染后HepG2细胞增殖活力、细胞周期及凋亡率的变化Table 1.The changes of viability，cell cycle and apoptotic rate of HepG2 cells treated with pEGFP-N2/XPD(Mean±SD.n=6)

2 pEGFP-N2/XPD转染对HepG2细胞周期的影响

流式细胞术结果显示，与空白对照组和空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的G1期细胞明显增多(P＜0.01)，S期细胞明显减少(P＜0.01);而空白对照组与转染空载质粒pEGFP-N2组之间相比，G1期细胞和S期细胞差异均无统计学意义(P＞0.05)，见图1、表1。

Figure 1.The change of cell cycle of HepG2 cells treated with pEGFP-N2/XPD.图1 pEGFP-N2/XPD转染后HepG2细胞周期的变化

3 pEGFP-N2/XPD转染对HepG2细胞凋亡率的影响

流式细胞术结果显示，重组质粒 pEGFP-N2/XPD组的细胞凋亡率明显高于空白对照组和空载质粒pEGFP-N2组(P＜0.01);而空白对照组与空载质粒pEGFP-N2组之间相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，见图2、表1。

Figure 2.The change of apoptotic rate of HepG2 cells treated with pEGFP-N2/XPD.图2 pEGFP-N2/XPD转染后HepG2细胞凋亡率的变化

4 pEGFP-N2/XPD转染对HepG2细胞的 XPD、Mdm2、Mdm4和P53 mRNA表达水平的影响

RT-PCR结果显示，与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，pEGFP-N2/XPD的转染明显增加了XPD mRNA的表达(P＜0.01);与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的Mdm2和Mdm4 mRNA的表达明显减少，P53 mRNA的表达明显增多(均 P＜0.01);而空白对照组与转染空载质粒pEGFP-N2组之间相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，见图3。

Figure 3.The changes of XPD，Mdm2，Mdm4 and P53 mRNA expression in HepG2 cells treated with pEGFP-N2/XPD.M:100 bp marker;A:blank control group;B:pEGFP-N2 group;C:pEGFP-N2/XPD group.Mean±SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs pEGFP-N2 group or blank control group.图3pEGFP-N2/XPD转染后HepG2细胞的XPD、Mdm2、Mdm4和P53 mRNA表达水平的变化

5 pEGFP-N2/XPD转染对HepG2细胞的 XPD、Mdm2、Mdm4和P53蛋白表达水平的影响

Western blotting结果显示，与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，pEGFP-N2/XPD的转染明显增加了XPD蛋白的表达(P＜0.01);与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的Mdm2和Mdm4蛋白的表达明显减少(均P＜0.01)，P53蛋白的表达明显增多(P＜0.05);而空白对照组与转染空载质粒pEGFPN2组之间相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，见图4。

Figure 4.The changes of XPD，Mdm2，Mdm4 and P53 protein expression in HepG2 cells treated with pEGFP-N2/XPD.A:blank control group;B:pEGFP-N2 group;C:pEGFP-N2/XPD group.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs pEGFP-N2 group or blank control group.图4pEGFP-N2/XPD转染后HepG2细胞的XPD、Mdm2、Mdm4和P53蛋白表达水平的变化

讨 论

Mdm2和Mdm4参与细胞调控的多条通路，在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用。目前已发现，很多人类肿瘤中都存在着Mdm2和Mdm4过度表达的现象［7］。在肿瘤细胞中，Mdm2和Mdm4的过表达，使得野生型P53(wt-P53)的抑癌活性丧失，抑制其抗肿瘤活性，促进肿瘤的形成。因此，Mdm2和Mdm4 是 wt-P53 的负调节因子［8］。Riedinger等［9］发现，通过抑制Mdm2和Mdm4以恢复P53的活性，可起到抑制肿瘤的作用［9］。在体外的动物实验中，通过基因敲除使得Mdm2和Mdm4缺失，这能诱导P53依赖的凋亡。而Mdm2和Mdm4异二聚体的形成对抑制P53活性起到了至关重要的作用［10］。本研究组既往的研究亦发现，通过RNA干扰技术使Mdm2表达下调，这抑制了肝癌细胞的增殖，并诱导其凋亡;同时，沉默Mdm2的表达能上调p21的表达，而后者是P53通路最重要的下游基因之一［11］。当然，Mdm2和Mdm4亦可通过非P53依赖的方式诱导肿瘤形成［12］。在抑制 P53方面，Mdm2和 Mdm4承担着不同却又互补的作用:Mdm2主要调节P53的稳定性，而 Mdm4 调节 P53 的活性［13］。

TFⅡH 是由 9 个亚基(XPB、XPD、P62、P52、P44、P34、cdk7、cyclinHT 和 MATl)组成的多酶复合物，XPD作为其支架，介导着复合物内部的连接［14］。XPD基因的突变与3种人类遗传性疾病有关，即着色性干皮病、Cockayne综合症和毛发硫性营养不良［15］。XPD具有单链DNA解旋酶活性，参与了核酸剪切修复，它的功能缺陷可导致突变的基因得不到有效的修复，同时也会影响一些癌基因和抑癌基因的功能，从而诱导肿瘤的发生［16］。

如上所述，XPD能起到抑癌基因的作用，而Mdm2和Mdm4可诱导肿瘤的发生。因此，我们可以假设:XPD能下调Mdm2和Mdm4的表达。为此，本研究用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD转染进入人肝癌细胞株以使得XPD高表达，然后检测Mdm2、Mdm4和P53表达量的变化，并观察肝癌细胞的增殖和凋亡。

本研究结果显示，XPD高表达可增加P53的表达，并能抑制肝癌细胞增殖及诱导其凋亡，这与本研究组既往的研究结果相一致［17-18］;另外，XPD高表达可降低 Mdm2和 Mdm4的表达。上述结果表明，XPD、P53与Mdm2、Mdm4之间存在着相互联系，共同影响着肝癌的发生与发展，也将为肝癌的治疗提供可能的分子作用靶点。

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