容量激活性氯离子通道在低氧高二氧化碳处理的大鼠PASMCs的表达及其与MAPK通路的关系*

黎关龙， 黄林静， 何金波， 马迎春， 陈海娥， 应 磊， 汪 洋， 王万铁△

(1温州医科大学基础医学院病理生理学教研室，浙江温州325035;2浙江省医学科学院卫生学研究所毒理学研究室，浙江杭州310013)

以往研究发现，容量激活性氯离子通道(volumeactivated chloride channel，CLC3)广泛存在于肺动脉平滑肌细胞上，与肌张力、细胞容量的调节和电活动有关［1］。Xiao 等［2］研究证实，阻断氯离子通道可明显抑制内皮素1诱导的主动脉平滑肌细胞增殖。Hisadome等［3］研究表明，CLC3阻断剂可显著抑制各类血管的生成，而且CLC3还与各种生物体的跨膜氯离子转运及相关物质分泌密切相关。本室先前研究表明［4］，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路抑制剂能够减弱低氧高二氧化碳引起的肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)的收缩反应。那么此作用与PASMCs上的 CLC3有无关系?尚缺乏实验证据。因此，本实验在低氧高二氧化碳大鼠模型上，观察CLC3在PASMCs中mRNA和蛋白表达的变化，并探讨MAPK信号通路在其中的作用。

材料和方法

1 动物

SPF级标准健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠14只，体重(220±30)g，由温州医科大学实验动物中心提供［SCXK(浙)2010-0101号］。

2 主要试剂

SB203580(Sigma);U0126(Sigma);二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO;上海申工生物技术有限公司);茴香霉素(anisomycin;Sigma);10%十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfonate，SDS;碧云天生物技术有限公司);四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine，TEMED;碧云天生物技术有限公司);其余试剂为国产分析纯。

3 主要方法

3.1 酶消化法取PASMCs 用10%水合氯醛3.3 mL/kg腹腔麻醉SD大鼠，在超净平台内迅速取出心肺组织，放入盛有4℃ PBS平衡盐缓冲液的培养皿中，取出左叶肺和右肺中最大的肺叶，分离肺动脉与周围组织，保留 3～4级动脉(直径300～700 μm)。去内外膜后将平滑肌剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，装入无菌离心管中，1 000 r/min离心3 min，去上清加入消化酶，于常氧培养箱内静置消化15 min后加入培养基5 mL，吹打。吸出细胞悬液收集于离心管中。原消化酶加回组织块中，37℃、5%CO2培养箱中继续消化5 min，按上述步骤收集细胞。再重复消化操作1～2次。以2×108/L的密度种植于培养瓶中，加入含20%胎牛血清的高糖培养基置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

3.2 PASMCs的传代培养 当细胞生长达培养瓶(培养皿)80% ～90%左右时，吸去培养液，用2～3 mL磷酸盐缓冲溶液(phosphate-buffered solution，PBS)清洗培养瓶2次，然后用0.25%胰蛋白酶消化细胞，时间大约为0.5～2 min，反复吹打使贴壁细胞脱落，离心、吹打，制成单细胞悬液。取10～30 μL计数，将适宜密度的单细胞悬液分置于3～4个培养瓶，加适量含15%胎牛血清的高糖培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞传代至第2代时可冻存。

3.3 PASMCs的冻存和复苏 (1)冻存:由于实验研究中经常使用第4～5代细胞，而大鼠细胞多次传代会引起异化，生物学性状发生改变，所以需将细胞早期细胞进行冻存。冻存步骤:细胞在第2代时，选择对数生长期细胞，在冻存前1 d换培养液。用胰蛋白酶根据传代方法消化单层生长细胞，1 000 r/min离心5 min，加入配制好的冻存培养液(含20%FBS、10%DMSO的DMEM培养液)，冻存液中细胞的最终密度为(5～10)×109cells/L，然后依次4℃、20℃、-70℃液氮保存。冻存须确保密封。(2)复苏:复苏细胞应快速融化，与冻存的要求相反。将冻存管投入37℃温水中，轻轻摇动使其尽快融化后用75%乙醇消毒，将液体移入无菌离心管，加入10倍培养液，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入1 mL液体吹打，接种细胞密度宜为5×108cells/L，次日观察并换液培养。

3.4 PASMCs存活率的测定 取消化传代的细胞悬液9滴，加入0.4%台盼蓝液1滴，混匀后3 min内吸取1滴于计数板上，静置3 min，在显微镜下观察。若细胞核染色，则为不正常细胞或死亡细胞;若未着色，则为存活细胞。

3.5 差异贴壁法纯化细胞 细胞传至3代后，按传代方法消化、吹打细胞，然后使细胞在第1瓶中贴壁15 min，光镜下可见部分细胞贴壁。后将第1瓶中培养基移入第2瓶中，使细胞再次贴壁15 min，光镜下又可见大部分细胞贴壁。最后再将第2瓶中培养基移入第3瓶中，再使细胞贴壁，后将3瓶均补齐培养基。继续培养1～2 d后，光镜下观察:第1瓶中以较大长梭形细胞为主，为成纤维细胞;第2瓶为混和细胞;第3瓶中为较纯的梭形平滑肌细胞。取第2瓶细胞继续培养，也可重复纯化几次获得较纯的平滑肌细胞［5］。

3.6 PASMCs的鉴定 倒置相差显微镜下观察细胞形态并摄片，激光共聚焦免疫荧光染色法分别检测DAPI(激发光波长488 nm，发射光峰值630 nm)标记的细胞核及FITC(激发光波长488 nm，发射光峰值525 nm)标记的α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗体。

3.7 实验分组 取第4～5代生长良好的对数生长期PASMCs制成细胞悬液，按2×108cells/L的密度接种于10 cm培养皿中，加入含15%胎牛血清的高糖培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养，待融合成单层细胞时(约80%铺满)换成无血清培养基饥饿24 h，同步后进行药物干预(30 min内完成加药操作)。(1)对照组(C):DMEM、5%CO2、21%O2、37℃、48 h;(2)低氧高二氧化碳组(H):DMEM、6%CO2、1%O2、37 ℃、48 h;(3)DMSO+ 低氧高二氧化碳对照组(D):0.05%DMSO、6%CO2、1%O2、37℃、48 h;(4)U0126+低氧高二氧化碳干预组(U):10 μmol/L U0126、6%CO2、1%O2、37 ℃、48 h;(5)SB203580+低氧高二氧化碳干预组(SB):10 μmol/L SB203580、6%CO2、1%O2、37 ℃、48 h;(6)anisomycin+低氧高二氧化碳干预组(A):10 μmol/L anisomycin、6%CO2、1%O2、37 ℃、48 h。以上每组6 皿细胞。

3.8 蛋白免疫印迹法检测PASMCs CLC3蛋白的表达 详细步骤参考李丹等［6］的实验方法。Quantity One凝胶软件分析系统分析CLC3灰度值，以目的蛋白CLC3条带灰度值和 β-actin灰度值比值代表CLC3表达的含量。

3.9 RT-PCR法检测PASMCs中CLC3 mRNA的表达 详细步骤参考李丹等［6］的实验方法。cDNA采用相应特异性引物进行PCR扩增，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列如下:CLC3上游引物 5’-GTAAATGGGTTGGTGATGCC-3’，下游引物 5’-CTGAGGGCAAATCCCACTAA-3’，产物 277 bp;β-actin 上 游 引 物 5’-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3’，下游引物 5’-TCGGGGGATCGGAACCGCTCA-3’，产物 400 bp。采用 Gel-Pro Analyzer软件分析测定吸光度(A)，以CLC3扩增带与β-actin扩增带的A值之比(relative A value)作为CLC3 mRNA的相对表达量。实验重复6次。

4 统计学处理

采用SPSS 17.0软件分析。计量资料均进行正态性检验，以均数±标准差(mean±SD)表示。多方差齐者组样本均数比较进行方差齐性检验，方差齐者组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较采用LSD法，方差不齐者进行Dunnett检验;双变量相关性分析采用Bivariate过程的Pearson相关分析法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 原代培养大鼠PASMCs的培养和鉴定

1.1 细胞形态学生长特点 平滑肌细胞原代培养72 h，此时细胞已经贴壁呈长梭形，换液后生长繁殖加快，间隙变小，成束的平滑肌细胞平行排列，部分细胞可多层重叠。培养到第5天后，细胞密度低时常交织呈网状，密度高时则呈旋涡状或者栅栏状，呈典型的“峰-谷”状生长。镜下显示细胞呈梭形，具有长短不等的数个突起，彼此融合，边界不清，折光性好，细胞核位于细胞中央，呈卵圆形，多为3～5个。传代培养的细胞生长规律与原代培养相似，传代后第2天生长繁殖活跃，4～6 d后生长进入平台期，可以进行下次传代，连续培养多代仍可保持较好状态，见图1A。

1.2 免疫细胞荧光法鉴定PASMCs 培养第4～5代的细胞经小鼠抗大鼠α-SMA单克隆抗体孵育，FITC和DAPI双染色后激光共聚焦显微镜下观察，约99%呈阳性反应。高倍镜下可见胞浆内FITC标记的α-SMA发绿色荧光，与细胞长轴平行呈纤维细丝状，此为α-SMA，仅平滑肌细胞呈阳性反应;DAPI标记的细胞核呈红色荧光，卵圆形居中，见图1B。

Figure 1.Primarily cultured rat PASMCs(A;×100)and their immunofluorescence identification(B;×400).Green:FITC-labelled α-SMA immunofluorescence;red:DAPI fluorescence.图1 大鼠肺动脉平滑肌细胞的原代培养和免疫荧光鉴定

1.3 台盼蓝染色结果 镜下共计数2 600个细胞，其中71个阳性细胞，阴性率为97.3%，说明用消化法传代的细胞存活率高。经冻存复苏后阴性率达87.2%，说明冻存复苏后的细胞存活率仍较高。

2 各组PASMCs CLC3 mRNA表达的变化

2.1 低氧高二氧化碳对PASMCs中CLC3 mRNA表达的影响 与C组相比，H组CLC3 mRNA表达量均显著增加，差异有统计学意义(P＜0.01)，见图2和表1。

2.2 低氧高二氧化碳条件下U0126和SB203580对PASMCs CLC3 mRNA表达的影响 与C组比较，H组、D+H组、U+H组、SB+H组及A+H组CLC3 mRNA表达均明显上调(均P＜0.01);与H组比较，D+H组CLC3 mRNA表达略微上调，但差异无统计学意义(P＞0.05)，U+H组和A+H组CLC3 mRNA表达显著下调(均P＜0.01)，SB+H组CLC3 mRNA表达均明显上调(P＜0.01);与D+H组比较，U+H组和A+H组CLC3 mRNA表达显著下调(均P＜0.01)，SB+H组CLC3 mRNA表达均明显上调(P＜0.01)，见图2和表1。

Figure 2.The expression of CLC3 mRNA in all groups.C:control group;H:hypoxic and hypercapnic group;D+H:DMSO+hypoxic and hypercapnic group;U+H:U0126+hypoxic and hypercapnic group;SB+H:SB203580+hypoxic and hypercapnic group;A+H:anisomycin+hypoxic and hypercapnic group.图2 各组细胞CLC3 mRNA的表达

表16 组PASMCs中CLC3 mRNA表达变化的比较Table 1. Changes of CLC3 mRNA expression in all groups(Mean±SD.n=6)

Figure 3.The expression of CLC3 protein in all groups.图3 各组细胞CLC3蛋白的表达

3 各组PASMCs中CLC3蛋白表达的变化

3.1 低氧高二氧化碳对PASMCs CLC3蛋白表达的影响 与C组相比，H组CLC3蛋白的表达显著上调，差异有统计学意义(P＜0.01)，见图3和表2。

3.2 低氧高二氧化碳条件下U0126和SB203580对PASMCs CLC3蛋白表达的影响 与C组比较，H组、D+H组、SB+H组CLC3蛋白表达均明显上调(均P＜0.01)，U+H组及A+H组CLC3蛋白表达轻微上调(均P＜0.05);与H组比较，D+H组CLC3蛋白表达略微下调，但差异无统计学意义(P＞0.05)，U+H组CLC3蛋白表达均明显下调(P＜0.01)，SB+H组CLC3蛋白表达均明显上调(P＜0.01)，A+H组CLC3蛋白表达轻微下调(P＜0.05);与D+H组比较，U+H组CLC3蛋白表达均明显下调(P＜0.01)，SB+H组CLC3蛋白表达均明显上调(P＜0.01)，A+H组 CLC3蛋白表达轻微下调(P＜0.05)，见图3和表2。

表26 组PASMCs中CLC3蛋白表达变化的比较Table 2. Changes of CLC3 protein expression in all groups(Mean±SD.n=6)

讨 论

CLC3 在血管平滑肌细胞上有高表达，4，4′-二异氰基芪-2，2′-二磺酸(4，4′-diisothiocyanatostilbene-2，2′-disulfonic acid，DIDS)可通过阻断氯离子通道、抑制内皮素使细胞膜去极化，从而导致的胞浆钙离子浓度升高及血管平滑肌细胞增殖，表明其可能在血管平滑肌细胞的生长调控上发挥重要的作用［7-8］。Voets［9］的研究也发现，CLC3与细胞增殖密切相关，表现在肌细胞增殖分裂过程中持续不断地调节其细胞容量。下调CLC3，肌细胞则停止增殖和分化;抑制CLC3时可有效抑制内皮细胞的增殖。本室先前研究显示，低氧高二氧化碳能够通过不同途径引发PAMSCs收缩、增殖，导致肺血管重塑［10］。本实验又发现，低氧高二氧化碳条件下PAMSCs中CLC3 mRNA和蛋白表达量较常氧条件下明显升高，表明低氧高二氧化碳可上调大鼠PASMCs上CLC3 mRNA和蛋白的表达，其机制可能是低氧高二氧化碳引起PASMCs膜通透性增加和［Ca2+］升高，细胞内［Ca2+］升高激活CLC3，氯离子大量外流，引起细胞膜去极化，继而开放电压依赖性钙通道，使细胞外Ca2+大量内流，细胞内［Ca2+］进一步升高，Ca2+与胞浆内的钙调素结合使肌球蛋白轻链激酶磷酸化，进而引发平滑肌细胞收缩、增殖。

Zhang等［11］认为，ERK1/2 通路和 p38 MAPK 通路之间可能存在某种相互制约关系，抑制p38 MAPK通路的同时可加强ERK1/2通路的激活，导致凋亡的延迟。而p38 MAPK促进凋亡或抑制凋亡与p38 MAPK激活的性质有关，如短期p38 MAPK的激活可引起造血肿瘤细胞KT6分化，长期p38 MAPK的激活则可促进其凋亡;在TNF-α处理的中性粒细胞中，早期 p38 MAPK的激活可延迟凋亡，而晚期 p38 MAPK的激活可加速凋亡［12］。因此，可以认为中、晚期p38 MAPK的高活化状态是一种保护机制，以此来对抗低氧高二氧化碳引起的肺血管壁增殖重塑。本实验显示:使用 SB203580后，PASMCs中 CLC3 mRNA和蛋白表达水平明显上调，显著高于低氧高二氧化碳组;应用U0126后，PASMCs CLC3 mRNA和蛋白表达水平却明显低于低氧高二氧化碳组。这提示p38 MAPK通路抑制剂SB203580可上调大鼠PASMCs CLC3 mRNA和蛋白的表达;ERK1/2通路抑制剂U0126能下调大鼠PASMCs CLC3 mRNA和蛋白的表达。

Anisomycin作为p38 MAPK通路的激活剂能够明显抑制单向或双向混合淋巴细胞反应中T细胞的增殖活性，抑制T细胞表面早期及中期活化标志分子CD69和 CD25的表达［13］。本实验也发现，CLC3 mRNA和蛋白含量在anisomycin干预下，较低氧高二氧化碳组明显降低，表明 anisomycin可下调大鼠PASMCs CLC3 mRNA和蛋白的表达。

综上所述，低氧高二氧化碳可上调大鼠PASMCs中CLC3的表达，可能引发平滑肌细胞增殖;p38 MAPK可能参与了抑制CLC3引起的大鼠PASMCs增殖;ERK1/2可能参与了 CLC3引起的大鼠PASMCs增殖。

［1］ Kurusu T，Nishikawa D，Yamazaki Y，et al.Plasma membrane protein OsMCA1 is involved in regulation of hypo-osmotic shock-induced Ca2+influx and modulates generation of reactive oxygen species in cultured rice cells［J］.BMC Plant Biol，2012，12:11.

［2］ Xiao GN，Guan YY，He H.Effects of Cl-channel blockers on endothelin-1-induced proliferation of rat vascular smooth muscle cells［J］.Life Sci，2002，70(19):2233-2241.

［3］ Hisadome K，Koyama T，Kimura C，et al.Volume-regulated anion channels serve as an auto/paracrine nucleotide felease pathway in aotric endothelial cells［J］.J Gen Physiol，2002，119(6):511-520.

［4］ 朱阿楠，王万铁，林丽娜，等.MAPK通路抑制剂对低氧高二氧化碳性肺动脉收缩的影响［J］.中国病理生理杂志，2008，24(8):1538-1542.

［5］ 李悦梅，冯大明，万载阳，等.组织块法培养大鼠肠系膜小动脉的平滑肌细胞［J］.南华大学学报:医学版，2003，31(3):251-253.

［6］ 李 丹，张艳华，陈少杰，等.大鼠肾缺血-再灌注后JNK mRNA及蛋白表达的变化及银杏达莫注射液的干预作用［J］.中国中西医结合肾病杂志，2011，12(4):303-307.

［7］ Duan DD.The ClC-3 chloride channels in cardiovascular disease［J］.Acta Pharmacol Sin，2011，32(6):675-684.

［8］ Matchkov VV，Secher Dam V，Bødtkjer DM，et al.Transport and function of chloride in vascular smooth muscles［J］.J Vasc Res，2013，50(1):69-87.

［9］ Voets T.Quantifying and modeling the temperature-dependent gating of TRP channels［J］.Rev Physiol Biochem Pharmacol，2012，162:91-119.

［10］朱阿楠，王园园，王淑君，等.ERK通路和三七总皂苷干预在低氧高二氧化碳性肺动脉高压中的作用［J］.中国病理生理杂志，2011，27(9):1796-1801.

［11］ Zhang YX，Kong CZ.The role of mitogen-activated protein kinase cascades in inhibition of proliferation in human prostate carcinoma cells by raloxifene:an in vitro experiment［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2008，88(4):271-275.

［12］ Nagata Y，Todokoro K.Requirement of activation of JNK and p38 for environmental stress-induced erythroid differentiation and apoptosis and inhibition of ERK for apoptosis［J］.Blood，1999，94(3):853-863.

［13］ Hori T，kondo T，Tabuchi Y，et al.Molecular mechanism of aptosis and gene expressions in human lymphoma U937 cells treated with anisomycin［J］.Chem Biol Interaet，2008，172(2):125-140.