不同倍性泥鳅鳍细胞系的建立及生物学特性分析

李 霞 马 辰 秦艳杰 李雅娟 吴 迪 白丽雯 刘 博

(1. 大连海洋大学, 辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室, 大连 116023;2. 大连海洋大学, 农业部北方海水增养殖重点实验室, 大连 116023)

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)隶属于鲤形目(Cypriniformes)、鳅科(Cobitidae), 广泛分布于中国大陆、朝鲜半岛、日本列岛、中国台湾等地[1]。泥鳅肉鲜味美, 营养丰富, 素有“水中人参”之称, 是我国重要的淡水养殖种类。除了二倍体, 泥鳅还存在有天然的三倍体、四倍体, 是生物学及遗传学研究的良好材料。关于泥鳅多倍体的研究以往的报道主要在人工诱导方法[2,3]、倍性鉴定方法[4,5]以及生长特性研究[2]等方面。多倍体泥鳅细胞系的建立及特性研究尚未见报道。

自Wolf, et al.在1962年建立了世界上第一株鱼类细胞系——虹鳟(Oncorhynchus mykiss)性腺细胞系RTG-2[6]以来, 鱼类细胞培养的研究发展迅速。到2011年全世界共报道建立鱼类细胞系275株, 包括淡水或溯河洄游性的鱼类细胞系 175株, 海水鱼类细胞系100 株[7]。用于体外培养的组织主要有鳍[8—10]、脾[9,11,12]、肾[13]等, 其中鳍组织细胞系有白鲟(Acipenser transmontanus)WSF细胞系[14], 大菱鲆(Scophthalmus maximus)鳍细胞系[15], 中华鲟(Acipenser sinensis)CSTF细胞系[16]等。本实验以天然生长的二倍体(2n)、三倍体(3n)及四倍体(4n)泥鳅为材料, 分别建立了可以连续传代的鳍组织细胞系并对其进行生长、细胞遗传学分析, 旨在丰富鱼类细胞系的种类, 为揭示多倍体鱼类生长、遗传等机制打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用的泥鳅采自湖北省洪湖市, 经流式细胞仪鉴定倍性后, 将二倍体、三倍体和四倍体泥鳅分别饲养在90 L水槽中, 投喂复合饲料, 日换水一次。泥鳅全长10.3—15.8 cm, 体重10.00—20.24 g。

实验所用 DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、胰酶、青霉素-链霉素双抗溶液为Hyclone公司产品;人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、I型胰岛素样生长因子(IGF-I)为Peprotech公司产品; 硫酸软骨素为Wolsen公司产品。其他化学试剂均为分析纯。

1.2 方法

原代培养 参照李霞等的方法[17]略有改动。试验前将鲜活的泥鳅浸泡于高双抗(1000 IU/mL青霉素, 1000 μg/mL链霉素)曝气水中暂养24h, 用1‰苯甲醇麻醉后, 在超净工作台中剪取鳍组织。将鳍组织先用质量浓度为 10%的碘伏浸泡 15min; 后用青霉素和链霉素的混合液(500 IU/mL青霉素,500 μg/mL链霉素)浸泡30min; 再分别用PBS漂洗两遍和 5%FBS-DMEM/F12培养基漂洗一遍后, 剪成1 mm3左右的小块并均匀接种于25 cm2细胞培养瓶中, 在 25℃CO2培养箱中正置干贴 24h后补加培养液至 5 mL/瓶, 所用培养液为添加有硫酸软骨素(10 μg/mL)、bFGF(10 ng/mL)和 IGF-I(20 ng/mL)的20% FBS-DMEM/F12培养基。启动原代培养至细胞长成单层。

传代培养 吸出培养瓶中的培养液, 加入0.25%的胰蛋白酶溶液1 mL, 30s后吸去胰蛋白酶溶液, 使得瓶底形成一层胰蛋白酶膜, 继续消化1min,轻磕细胞培养瓶。将之前吸出的培养液加回, 用吸管吹打, 制成细胞悬液; 将细胞悬液以体积比 1︰1分到两个新的培养瓶中; 并补加培养液至5 mL; 在25℃CO2培养箱中培养至细胞长成单层后继续用此方法传代。从原代培养传代至30代所用的培养液为添加有硫酸软骨素(10 μg/mL)、bFGF(10 ng/mL)和IGF-I(20 ng/mL)的20%FBS-DMEM/F12培养基, 30代以后所用培养液为 20%FBS-DMEM/F12培养基,停止添加硫酸软骨素、bFGF和IGF-I。

细胞保存方法 参照李霞等的方法[17]。首先配制含 20%FBS、60%DMEM/F12和 20%二甲基亚砜的细胞冻存液, 并放置于4℃冰箱中保存备用。取40代以后生长旺盛的细胞, 用0.25%的胰酶溶液消化, 加入培养液重悬后, 1500 r/min离心5min, 弃上清, 向沉淀中加入1 mL细胞冻存液, 重悬, 调整细胞浓度至 1.0×106个/mL, 并转至冻存管中。放置冰箱中逐渐降温: 4℃冰箱中 30min, –20℃冰箱中2h、–80℃冰箱中 24h, 最后放入液氮中(–196℃)长期保存。

取保存液氮中 60d的细胞, 在 40℃水中解冻,待细胞冻存液融化后转入25℃水浴中3min, 然后将细胞冻存液转入到离心管中, 并加入等量DMEM/F12培养基, 1500 r/min离心5min, 弃上清,用 20%FBS-DMEM/F12培养基重悬细胞, 转入到25 cm2细胞培养瓶中, 并补加培养基至 5 mL, 在25℃CO2培养箱中培养 24h后全量换培养液, 继续培养。同时, 取少量重悬的细胞液加入胎盘蓝染色,并用血球计数板计数, 计算存活率。

存活率=活细胞数/细胞总数×100%染色体分析 参考Wang, et al.的方法[14], 每10代取三种倍性泥鳅鳍细胞做染色体分析。向细胞液中加入终浓度为 1 μg/mL秋水仙素, 并将培养瓶置于25℃CO2培养箱中继续培养, 3—5h后用0.25%的胰酶溶液消化, 细胞转入离心管中, 以 1500 r/min离心5min, 收集细胞。用0.075 mol/L KCl溶液低渗40min, Carnoy固定液固定15min, 固定三次后滴片,干燥后用Giemsa染液染色, 高倍镜下观察拍照, 计数染色体数目, 并进行核型分析。

细胞生长曲线的测定 待三种倍性泥鳅鳍细胞分别传代至 50代时, 用 0.25%的胰酶溶液消化,细胞重悬, 按每孔500 μL接种于24孔细胞板中, 接种密度为(3.0—5.0)×104个/mL, 置于 25℃CO2培养箱中培养, 每24h取3孔细胞用血球计数板计数, 连续进行 7d。以培养时间(d)为横坐标, 细胞浓度(个/mL)为纵坐标, 绘制三种细胞的生长曲线。根据公式T=t×Lg2/Lg(Nt/N0)可计算出细胞的群体倍增时间,其中, Nt为时间t后的细胞数, N0接种细胞数。

细胞及细胞核大小测定 取 53代的三种倍性泥鳅鳍细胞, 用 0.25%的胰酶溶液消化, 细胞重悬, 用移液枪取200 μL细胞液加胎盘蓝1︰1混合加入到血球计数板中, 在显微镜下, 用校正好的目镜测微尺测算直径并进行统计。细胞传至 53代时, 在倒置显微镜下观察贴壁细胞, 计 100个圆形细胞核,用校正好的目镜测微尺测算其直径并进行统计。

数据处理 实验数据用平均值±标准差的方式表示, 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。

2 结果

2.1 原代培养

二倍体泥鳅鳍组织培养 48—60h后有细胞从组织块中迁出(图1A), 并呈纤维样, 6—7d后组织块周围形成单层, 培养30—32d后细胞即可长满培养瓶瓶底。三倍体泥鳅鳍组织培养36—48h后有细胞从组织块中迁出(图 1B), 呈纤维样, 3—4d后组织块周围形成细胞单层, 培养28—30d后细胞即可长满培养瓶瓶底。四倍体泥鳅组织培养48—60h后有细胞从组织块中迁出(图 1C), 并呈纤维样, 5—6d后组织块周围形成单层, 培养26—28d后即可铺满整个培养瓶瓶底。

2.2 传代培养及细胞系的建立

三种细胞传代后 6—7d即可长满培养瓶瓶底,连续传代10代后, 细胞增殖速度加快。二倍体4—5d即可长满单层, 三倍体 2—3d即可长满单层, 四倍体3—4d即可长满单层。三种细胞生长状态良好, 细胞透明, 形态均一, 呈纤维样。30代以后停止添加人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、I型胰岛素样生长因子(IGF-I)和硫酸软骨素, 细胞生长及分裂状况都未受到影响。目前, 二倍体泥鳅鳍细胞已传代至59代(图2A)、三倍体和四倍体泥鳅鳍细胞均已传代至68代(图2B、C), 成功建立三种倍性泥鳅鳍组织细胞系。

图1 二倍体、三倍体和四倍体泥鳅鳍组织原代培养细胞Fig. 1 Primary cultured diploid, triploid and tetraploid fin cells of oriental weatherfish

图2 二倍体、三倍体和四倍体泥鳅鳍组织传代培养细胞Fig. 2 Passage cultured diploid, triploid and tetraploid fin cells of oriental weatherfish

2.3 细胞保存

三种倍性的泥鳅鳍细胞冻存复苏后, 多数细胞都可以继续存活, 细胞形态均一为纤维样细胞, 3—4d长满单层, 并且可以继续传代。二倍体、三倍体及四倍体细胞冻存后存活率分别为: (80.88±1.38)%、(84.48±1.13)%、(81.57±1.28)%, 经统计分析, 三者之间不存在显著差异(P<0.05)。

2.4 染色体分析

每传十代, 对三个倍性的鳍细胞进行染色体分析。在统计的 100个分裂相中, 二倍体细胞染色体数目分布从 33到56不等, 但分裂相染色体数目出现频率最高是50条; 三倍体细胞染色体数目分布从48到 89不等, 但是分裂相染色体数目出现频率最高是75条; 四倍体细胞染色体数目分布从87到103不等, 但分裂相染色体数目频率最高是 100条。可见, 二倍体、三倍体及四倍体的染色体数目分别为50、75和100。

对三个倍性的50代鳍细胞进行染色体分析结果如下: 二倍体细胞染色体数目分布从 33到 55不等, 而有 50条染色体的细胞数占总细胞数的68%(图3A); 三倍体细胞染色体数目分布从54到77不等, 而有75条染色体的细胞数占总细胞数的59%(图 3B); 四倍体细胞的染色体数目分布从 87到101不等, 而拥有100条染色体的细胞数占总细胞数的 54%(图 3C), 说明传代后各细胞系染色体稳定。

对不同倍性的泥鳅鳍细胞进行核型分析, 结果表明, 二倍体、三倍体及四倍体的核型公式分别为2n=50, 10m+4sm+36t, NF=64 (图 4A、D); 3n=75, 15m+6sm+54t, NF=96 (图 4B、E); 4n=100, 20m+8sm+72t,NF=128 (图4C、F)。即二倍体、三倍体及四倍体细胞有5组中部着丝粒染色体(m), 2组亚中部着丝粒染色体(sm), 18组端部着丝粒染色体(t)。

图3 第50代二倍体、三倍体和四倍体鳍组织细胞染色体分布Fig. 3 Number distribution of chromosome in diploid, triploid and tetraploid fin cells at passage 50

2.5 细胞生长曲线测定

从第 50代细胞生长曲线(图 5)中可以看出,25℃、5%CO2、20%FBS-DMEM/F12条件下二倍体细胞在0—1d处于潜伏期, 在1—1.5d进入对数生长期, 在4—4.5d进入稳定期, 在5d后进入衰退期; 三倍体细胞在0—1d处于潜伏期, 在1—1.5d进入对数生长期, 在 3—3.5d进入稳定期, 在 5d后进入衰退期; 四倍体细胞在0—2d处于潜伏期, 在2—2.5d进入对数生长期, 在 4—4.5d进入稳定期, 在 5d后进入衰退期。经测算, 在以上培养条件下, 二倍体、三倍体和四倍体鳍细胞的倍增时间分别为 48.43h、36.01h和41.45h。

2.6 细胞及细胞核大小

细胞核大小 从测算的结果看, 培养的二倍体、三倍体、四倍体细胞核的直径、面积、体积间都有极显著差异(P<0.01)。二倍体、三倍体和四倍体细胞的细胞核直径比为 1︰1.15︰1.25; 细胞核面比为 1︰1.33︰1.57; 细胞核体积比为 1︰1.53︰1.97(表 1)。

细胞大小 从测算的结果看, 培养的二倍体、三倍体、四倍体细胞的直径、面积、体积之间都有极显著差异(P<0.01)。其中二倍体、三倍体和四倍体的细胞直径比为1︰1.11︰1.33; 细胞面积比为1︰1.23︰1.78; 细胞体积比为1︰1.37︰2.37(表2)。

3 讨论

3.1 泥鳅鳍细胞系建立方法

培养材料无菌是细胞体外培养成功的关键之一。已有的报道大多采用双抗或酒精侵泡处理暴露在体外的器官, 如大菱鲆鳍细胞系建立中用 70%酒精漂洗鳍组织[15]; 大泷六线鱼鳍、吻端组织培养前对其使用双抗(100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)浸泡处理[17]。本研究在对泥鳅鳍组织无菌处理中发现, 上述方法均存在灭菌不彻底的问题。通过反复尝试做了如下改进: 首先用质量浓度为 10%的碘伏浸泡 15min; 然后用双抗溶液(500 IU/mL青霉素、500 μg/mL链霉素)浸泡30min, 达到很好的无菌处理效果。碘伏是一种以表面活性剂为载体和增溶的不定型络合碘, 具有性能稳定, 使用方便, 缓慢释放有效碘和长效杀菌的优点, 在水产养殖中被广泛使用。

图4 第50代二倍体、三倍体及四倍体泥鳅鳍细胞染色体核型分析Fig. 4 Chromosome and Karyotype analysis of diploid,triploid and tetraploid fin cells at passage 50

图5 第50代二倍体、三倍体及四倍体鳍细胞的生长曲线(该图中纵坐标细胞数应为104)Fig. 5 The growth curve of diploid, triploid and tetraploid fin cell at passage 50

在鱼类细胞培养中, 常使用的培养基有DMEM/F12、DMEM 和 L-15等。本文参考大泷六线鱼鳍、吻端、肾[17]的培养方法, 在泥鳅鳍细胞培养过程中使用含20%FBS的DMEM/F12培养基, 与魏云波等[18]建立的褐点石斑鱼三种细胞系和Imajoh, et al.[19]报道的真鲷细胞系采用的最适培养基相同。在其他鱼类细胞培养过程中也有采用L-15培养基的, 效果也较好, 如秦启伟等[20]建立的斜带石斑鱼脾脏细胞系、樊廷俊等[15]建立的大菱鲆鳍细胞系。

鱼类细胞系的来源主要有肾、脾、吻端、心脏、鳍等[21], 在解剖获得内脏器官时, 必然造成鱼体死亡。本实验采用鳍组织为材料。鳍是易于再生的器官, 剪去一段后, 剩余部分仍能很快修复, 而鱼不会死亡, 这对珍贵材料的重复利用和保护非常有益。目前, 二倍体、三倍体和四倍体泥鳅鳍细胞已传至59代、68代、68代, 成功建立三个倍性的泥鳅鳍细胞系。

表1 二倍体、三倍体及四倍体泥鳅鳍细胞核大小Tab. 1 The size of nuclears of diploid, triploid and tetraploid fin cell in M. anguillicaudatus

表2 二倍体、三倍体及四倍体泥鳅鳍细胞大小Tab. 2 The size of passage fin cells in diploid,triploid and tetraploid M. anguillicaudatus

3.2 泥鳅鳍细胞染色体分析

染色体数目、核型是细胞遗传学的基础, 是鉴定细胞系种属以及体外培养条件下细胞系是否发生转化的可靠指标。在每十代进行的染色体分析中,三种倍性的细胞系均出现染色体非整倍体现象, 但是染色体数出现频率最高的都分别在50、75和100,即特征染色体数目仍分别是50条、75条和100条。对二倍体、三倍体和四倍体细胞进行核型分析发现,三者均具有5组中部着丝粒染色体(m), 2组亚中部着丝粒染色体(sm), 18组端部着丝粒染色体(t)。与李雅娟等[1]报道的二倍体、三倍体及四倍体泥鳅染色体数目分析和核型研究一致, 证明这三种细胞系确为二倍体、三倍体及四倍体泥鳅细胞系, 并且到目前为止, 细胞系尚未发生变异。

3.3 不同倍性泥鳅鳍细胞大小及增殖情况比较

一般认为细胞核大小与染色体数目成正比, 而且为了维持恒定的核质比率, 随着细胞核的增大,细胞大小也按比例增加[22], 即二倍体、三倍体及四倍体的细胞核体积的理论比值应为1︰1.5︰2。红细胞核的大小是鱼类多倍体鉴定的重要指标[22]。但以往报道的三倍体与二倍体的红细胞核体积比和红细胞体积比值都有不同结果。三倍体鲢红细胞核体积为二倍体的1.63倍[23], 大黄鱼三倍体红细胞及核的体积分别是二倍体的 1.97、1.70倍[24]。Kim, et al.提出三倍体泥鳅的红细胞及核的体积分别是二倍体的1.52和1.77倍[2], 而吴萍等的实验结果表明三倍体泥鳅的红细胞及核的体积分别是二倍体的1.62和1.44倍[5]。对于四倍体, Refstie提出虹鳟二倍体与四倍体红细胞体积之比为 1︰1.91, 红细胞核体积之比为 1︰2.05[25]; 而马涛等的研究发现二倍体与四倍体虹鳟红细胞面积之比为 1︰2.00, 红细胞核体积之比为 1︰2.42[26]。在本实验中测得的体外培养泥鳅二倍体、三倍体和四倍体的鳍细胞及核的体积比分别是 1︰1.37︰2.37和 1︰1.53︰1.97, 接近理论比值。上述研究结果的差异可能和测量方法、细胞状态等有关。

本文通过泥鳅鳍细胞和细胞核大小的比较认为随倍性增加, 不仅细胞核体积增大, 细胞体积也有明显增加, 所以如果不同倍性泥鳅体内细胞数量一致的话, 那么倍性越高, 个体应该越大。群体倍增时间是细胞总数增加一倍所需要的时间。对三种倍性鳍细胞群体倍增时间比较可以看出二倍体最长, 三倍体最短, 可见三倍体细胞在传代过程中能够更快地适应环境, 细胞活力好, 分裂快, 生长旺盛。已有研究表明三倍体泥鳅的平均体重大于二倍体, 且生长速度也比二倍体快[2], 结合本实验的研究结果认为, 这一现象可能和三倍体细胞大、群体倍增时间短即生长速度快有关。从细胞学角度揭示多倍体鱼类生长态势、抗逆特性的机理将是多倍体研究的一个重要方向[27], 而本研究所建立的多倍体泥鳅细胞系无疑将为这项研究的开展提供了必要的细胞学平台。