不同产地石榴皮总黄酮含量及抗氧化活性比较研究

安徽省铜陵市食品药品检验所（244000）钱世兵

安徽省铜陵职业技术学院（244000）开伟华Δ

伽蓝(集团)股份有限公司（200233）金家宏 李慧 夏增华

石榴（Punica granmumLinn.）为石榴科（Punicaceae）石榴属（Punica）落叶灌木或小乔木，别名安石榴、海榴，分布在亚热带及温带地区，我国南北各地区均有种植，其中陕西、安徽、山东、江苏、河南、四川、云南及新疆等地分布较多。石榴皮为石榴的干燥果皮，秋季果实成熟后收集果皮，晒干；性温，味酸、涩，归大肠经，具有涩肠，止血，驱虫等功效。可治久泻，久痢，便血，脱肛，滑精，虫积腹痛，疥癣等。临床用于腹泻、溃疡性结肠炎等的治疗[1][2][3]。

研究显示，石榴皮提取物含有高达24.9%的多酚类化合物，其中类黄酮物质占6%，而黄酮类化合物因在抗衰老等方面具有良好的作用，具有清除自由基和抗氧化的能力而备受关注[4]，且已被证实与石榴皮中抗氧化作用有关[5]。为了发掘更好的石榴皮药用资源，本研究采用三氯化铝络合法测定不同产地的石榴皮中总黄酮含量及其DPPH自由基清除作用，对不同产地、品种的石榴皮的抗氧化作用进行评价，以期为石榴资源的综合开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 市售石榴，分别产自上海（鲜石榴）、陕西临潼（酸石榴）、山东枣庄（鲜石榴）、新疆乌鲁木齐（鲜石榴）、云南蒙自（干燥皮）、安徽怀远（鲜石榴）、云南玉溪（酸石榴）、云南玉溪（鲜石榴）、安徽亳州（干燥皮）和上海（饮片，碳制）。新鲜石榴收集后，分离皮、果汁和种子，果汁浓缩至干，备用；石榴皮和种子60℃下鼓风干燥，粉碎至粗粉，保存于干燥避光处备用。

1.2 仪器 T6紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）、旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）、电子分析天平（Shimadzu）、鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、自动双蒸纯水蒸馏器（上海和泰仪器有限公司）、容量瓶、离心管、具塞试管。

1.3 试剂与配制

1.3.1 试剂 DPPH（二苯基苦味酰基苯肼，Sigma Aldrich）、Vc （分析纯，上海骏惠化工有限公司）、槲皮素标准品（98%，Sigma Aldrich）、无水乙醇（分析纯，中国上海振兴化工一厂）、95%乙醇（分析纯，中国上海振兴化工一厂）、甲醇（分析纯，中国上海振兴化工一厂）；三氯化铝（分析纯，Sigma Aldrich）。

1.3.2 配制 DPPH乙醇溶液的配制：准确称取6mg DPPH，用95%乙醇（或无水乙醇）溶解并定容于200ml容量瓶中，DPPH浓度为76μmol/L，避光保存（0～4℃）。

附表1 10种产地和来源石榴皮抗氧化活性结果

附表2 10种产地和来源石榴皮总黄酮含量

1.4 方法

1.4.1 抗氧化活性测定[6][7][8]

1.4.1.1 供试品制备 石榴皮提取物制备：取石榴皮粗粉20g，加70%乙醇按m（料）∶V（液）＝1∶10浸泡3h，超声提取30min（500W），滤液浓缩至干，加适量水配置成10mg/ml母液，备用。

1.4.1.2 测定方法 取样品溶液和DPPH·溶液按照等体积比加入同一具塞试管中，摇匀，在避光条件下反应30min后用分光光度计在525nm处测定吸光度T。同时测定DPPH溶液与等体积纯水混合液的吸光度C，以及待测液与等体积95%乙醇混合液的吸光度T0。根据下列公式计算清除率：清除率＝[1-（T-T0）/C]×100%。同时，本实验采用Vc作为对照组。

1.4.1.3 半清除率（IC50）的测定 半清除率指清除率为50%时所需样品的浓度。将待测抗氧化剂配制成系列溶液，测定各浓度抗氧化剂对DPPH自由基清除率，在清除率0%～100%的范围内，绘制清除率对浓度曲线，计算出清除率为50%时的浓度值，即为IC50值。IC50越低，说明抗氧化活性越高。

1.4.2 总黄酮含量测定[9]

1.4.2.1 供试品制备 同1.4.1.1项下供试品制备。

1.4.2.2 对照品溶液的制备 槲皮素标准溶液：精密称取在120℃干燥至恒重的槲皮素对照品10mg于100ml容量瓶中，用70%乙醇溶解稀释定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液备用（每1ml含槲皮素0.1mg）。

1.4.2.3 测定方法 三氯化铝显色法：分别取石榴皮提取液和槲皮素对照品溶液各1ml于2支10ml具塞试管中，加入1ml 1%三氯化铝（甲醇）液，甲醇定容，摇匀，15min后用在200～500nm波长范围内进行扫描，以不加显色剂的溶液为空白。经比较选择以410nm处为最大吸收波长。

2 结果

2.1 石榴皮提取物抗氧化活性 10种产地的石榴皮提取物，按照1.4.1项下抗氧化活性测定方法，分别进行DPPH自由基清除实验，结果见附表1。由附表1可见，不同产地的石榴皮的抗氧化活性存在明显差异（IC50：5.1±1.0～19.2±1.8μg/ml）。其中，酸石榴（云南玉溪、陕西临潼产）较其他石榴皮抗氧化活性强，并且以云南玉溪产酸石榴皮抗氧化活性最好；其他产地的石榴皮中，新疆乌鲁木齐和安徽怀远产石榴皮抗氧化活性最强，且与炮制后石榴皮饮片的抗氧化活性相当。

2.2 石榴皮提取物总黄酮含量 10种产地和来源的石榴皮提取物，按照1.4.2项下总黄酮含量测定方法，分别进行总黄酮含量的测定，结果见附表2。由附表2可以看出，不同品种、产地的石榴皮的总黄酮含量存在明显差异（55.18～117.04mg/g），酸石榴皮中总黄酮含量最高，并且以云南玉溪与陕产酸石榴皮总黄酮含量最高；其他产地石榴皮中，以新疆乌鲁木齐和安徽怀远产石榴皮总黄酮含量较高。

3 讨论

石榴作为药食两用植物，不但营养丰富，而且具有较为广泛的药用价值，在唐代《本草拾遗》及明代《本草纲目》中均有记载：石榴具有生津化食、抗胃酸过多、软化血管、解毒的功能[10][11]；石榴皮均有抗菌、抗病毒的作用[12]，临床用于腹泻、溃疡性结肠炎等的治疗。

大量研究显示，石榴含有多种生理活性成分，具有抗氧化、清除自由基、预防心脑血管疾病等多种功能，而作为占石榴20～30%的石榴皮还没有得到充分的利用，大部分都被废弃，造成严重的资源浪费。因此，石榴皮的合理开发对于石榴的开发具有重要意义。

通过本次研究可以发现，不同产地的石榴皮在总黄酮含量以及抗氧化活性存在较大差异。此外，总黄酮含量较高的石榴皮抗氧化作用也较好，两者呈正相关性。因此，总黄酮可能是石榴皮具有抗氧化活性的物质基础。

此外，笔者比较酸石榴和甜石榴的数据时发现，产自云南玉溪和陕西临潼的酸石榴在总黄酮和抗氧化活性远高于甜石榴。这也与当地酸石榴主要作为药用相互印证。尤其是云南玉溪产地的酸石榴其DPPH清除率的IC50达到0.005mg/ml，接近于公认的强抗氧化剂Vc（0.003mg/ml）。这也对酸石榴的进一步开发利用提供了理论依据。

这一研究结果对于开发利用石榴皮提供了一定的参考依据。若利用这部分废弃资源开发新型黄酮制剂，尤其是抗氧化剂的开发利用，可增加石榴的附加值，提高经济效益。