不同产地显齿蛇葡萄中二氢杨梅素测定

王家胜，何磊磊，张 妮，孔 琪，玉秋萍，余正文(贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳 550001)

显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang［1］富含黄酮化合物，主要分布在武夷山、罗霄山、南岭、武陵山等山地地区，闽、赣、湘、粤、桂、鄂、黔等省各自均为广泛分布区。其嫩茎叶经揉制、干燥，即为民间 (土家族、瑶族)特色茶饮。产品多为白霜 (二氢杨梅素)覆裹，揉制恰当则可呈现绿茶色泽，茶叶有卷曲状、团状、饼状等，不少茶厂的产品常辅以叶柄、嫩茎等，市场常见藤茶、莓茶、客家白茶等多种名称。

显齿蛇葡萄的主要活性成分为二氢杨梅素［2］，其干叶中二氢杨梅素含有量高达40%［3］。中国显齿蛇葡萄资源丰富，但各产区植株的二氢杨梅素含有量尚无系统性数据。本研究以超声波辅助提取、HPLC法检测的方法［4］，获得不同产地显齿蛇葡萄中二氢杨梅素含有量数据，分析各地显齿蛇葡萄的资源特点。

1 材料与方法

1.1 试验材料 植物原料于2013年5月3日—20日采自江西省、湖南省、湖北省、贵州省、广西省、广东省不同乡镇。不同植株的采点间隔不小于200 m，单株叶片约200 g作为一个样品，自然晾干，装袋。

二氢杨梅素对照品为实验室自制，纯度大于98%;甲醇和乙腈为色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司产品，其余试剂均为分析纯。

试验仪器和设备主要有KQ-500DE型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)，分析天平 (十万分之一，梅特勒-托利多仪器有限公司)，多功能粉碎机LX-02(上海江信科技有限公司);Agilent 1200LC(美国安捷伦科技有限公司);Dikma色谱柱 (250 mm×4.60 mm，5 μm，中国迪马公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件 进样量10 μL;紫外检测波长292 nm;柱温40℃;流动相为0.1%磷酸-甲醇-乙腈梯度洗脱 (0～10 min，74.4∶8∶17.6;10～15 min，36∶20 ∶44;15.1～18 min，74.4 ∶8 ∶17.6);体积流量1 mL/min。

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取二氢杨梅素100.00 mg，置于100 mL棕色量瓶中，以甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀，得到质量浓度为1.00 mg/mL的二氢杨梅素对照品溶液，分别量取1.0、2.0、4.0、5.0、8.0、10.0 mL，甲醇定容至 10 mL，得系列对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液制备 样品于50℃烘干，取30.0 g干样，粉碎45 s，过40目 (0.42 mm)筛。差量法称取样品0.1000 g于10 mL量瓶中，甲醇定容，浸泡12 h，100 kHz超声辅助提取60 min后冷却，取2 mL滤液用甲醇定容到10 mL，过0.22 μm滤膜，得到供试品溶液。

1.2.4 线性关系考察 对照品溶液进样10 μL，测定峰面积，每个质量浓度进样3次，取平均值。以进样质量浓度为横坐标 (X)、峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得二氢杨梅素的回归方程为Y=2832.7X－101.24(r2=0.9960)，线性范围为0.5～10.0 μg，表明在此范围内二氢杨梅素线性关系良好。

1.2.5 精密度试验 供试品溶液进样10 μL，重复进样5次，测定二氢杨梅素吸收峰面积，进行精密度试验，RSD值为0.41%～1.95%。

1.2.6 重复性试验 称取同一样品5份，按照“1.2.3”项制备供试品溶液，进行重复性试验，RSD为0.07% ～0.24%。

1.2.7 回收率试验 取已测定的显齿蛇葡萄样品9份，按照样品中二氢杨梅素含有量的0.8、1.0、1.2倍加入对照品，制备供试品溶液，进行回收率试验，加样回收率为90.01%～96.24%。

方法学考察结果表明本研究建立的提取和分析方法能够满足二氢杨梅素定量分析的要求。

1.3 样品测定 供试品溶液进样10 μL，获得样品色谱图 (图1)，通过回归方程计算二氢杨梅素的量 (表1)。

2 结果与分析

2.1 测定结果分析 检测结果显示各样品中二氢杨梅素含有量在2.50%～39.50%之间，含有量较低的采样点为大余县、衡东县、恭城县、平乐县，基本低于15%，酉阳县、来凤县、黎川县的较高，多为20%～35%。

图1 对照品及样品中二氢杨梅素高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of dihydromyricetin in reference substance and sample

表1 不同采样点显齿蛇葡萄中二氢杨梅素的量Tab.1 Contents of dihydromyricetin in Ampelosis grossedentata from different habitats

2.1.1 二氢杨梅素含有量具有地区差异性 表1显示，广东省、广西省、江西省大余县、湖南省衡东县采样点总体上比其他点低;广西省恭城县范围集中在10%～15%，其邻县平乐县为15% ～20%;江西省黎川县平均值为34.20%，而大余县为13.30%，湖南省衡东县为8.83%，体现出较为明显的地区差异性。

2.1.2 同一产地不同植株二氢杨梅素量具有差异性 相对于江西黎川县各采样点差异范围(27.24%～39.50%)，广西恭城县 (4.16% ～29.14%)、广西平乐县 (2.50% ～19.54%)、江西大余县 (5.31% ～25.31%)、贵州石阡县(4.11%～28.23%)产显齿蛇葡萄中二氢杨梅素量出现较大浮动。

2.2 区域分布特点分析

2.2.1 不同山脉 结果显示，各产地显齿蛇葡萄叶二氢杨梅素量有较明显差异，武夷山、武陵山所跨省区及贵州省境内佛顶山产者二氢杨梅素含有量较高，多数样品高于20%，而南岭、罗霄山产者二氢杨梅素量较低，在所采35个样品中有17个样品低于15%。

2.2.2 水平分布 长江流域产区二氢杨梅素量整体高于北回归线附近的岭南产区 (图2)。根据各采样点的测定情况，可知江西、湖北、重庆、贵州产显齿蛇葡萄中二氢杨梅素量处于较高水平，湖南、广西、广东样品的二氢杨梅素量整体处于较低水平。江西等省市均处长江流域，受亚热带季风气候影响，四季分明［5］，年积温高，光、热、水、土条件优越，适合二氢杨梅素的代谢积累;广西等省采样点分布在北回归线附近，高温多雨为主要气候特征，适合显齿蛇葡萄营养生长，但本研究结果表明对二氢杨梅素积累的促进作用不明显。

图2 不同产地二氢杨梅素的水平分布图Fig.2 Horizontal distribution of samples containing different levels of dihydromyricetin

2.2.3 垂直分布 南岭、罗霄山采样点的海拔在200 m，所采植株多分布在较背光区域，导致生长期内光热条件不能满足二氢杨梅素大量积累的条件;武夷山西麓的黎川县海拔为400～600 m，同期温度较高，光照充足，二氢杨梅素含有量整体处于较高水平;武陵山、佛顶山采样点海拔多为800～1000 m。从各产区来看，二氢杨梅素含有量与海拔整体上呈正相关 (图3)。

不同产地植株中二氢杨梅素量在纬度、海拔因素上体现出鲜明的特点，结果表明纬度高 (集中在长江流域)、海拔高 (大于400 m)的地区更适合二氢杨梅素积累。不同产地、同一产地不同植株的二氢杨梅素含有量具有差异性，也可能是由各株的遗传因素造成的。

3 结语

图3 不同产地二氢杨梅素的垂直分布规律Fig.3 Vertical distribution characteristic of samples containing different levels of dihydromyricetin

本研究采样点所在的各显齿蛇葡萄主产区［5-6］，当地民间具有悠久的采茶、制茶、用茶历史［7-9］，以其作为茶饮 (藤茶)原料，同时形成了各自的藤茶文化［10-12］，并且多数地区有较为规范的藤茶加工企业。本研究的数据可为加工企业收购原料提供参考指标，同时可用于判定藤茶产品中二氢杨梅素的含有量情况，为生产、研发提供依据，进而为合理开发和利用显齿蛇葡萄野生资源提供一定依据。

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