HPLC法同时测定丹参药材中丹酚酸B、丹参酮ⅡA含量

2014-11-02罗娟敏苏加坤田耀伟蔡继宝

亚太传统医药 2014年2期

罗娟敏，苏加坤，田耀伟，蔡继宝

(江西中烟工业有限责任公司技术研发中心，江西南昌 330096)

丹参为我国传统名贵中药材，是唇型科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)的干燥根及根茎，性味苦微寒，是中医常用活血化淤中药，俗称“一味丹参抵四物”。具有祛淤止痛、活血通经、清心除烦等功效[1]，临床用于治疗冠心病[2]、脑血栓、肝硬化等疾病[3]。丹参含有多种成分，其中脂溶性的二萜醌类(diterpenequinones)和水溶性的酚酸类(depsides)成分被认为是丹参药材中的主要药理活性成分[4]。本实验建立了可同时测定丹参中丹酚酸B、丹参酮ⅡA含量的HPLC法。

1 材料与仪器

Agilent 1100高效液相色谱系统，配DAD检测器(Agilent公司，美国)，Milli-Q 超纯水仪(Millipore公司，美国)，Waters C18色谱柱(150mm × 3.9mm，5μm)，BSA124S 天平(Sartorius)。

乙腈(色谱纯，TEDIA)、甲酸(色谱纯，TEDIA)、超纯水、丹酚酸B标准品(中国食品药品检定研究院，111562-201110)、丹参酮ⅡA标准品(中国食品药品检定研究院，110766-200619)、丹参标准药材(中国食品药品检定研究院，120923-201113)、丹参药材分别购于某市的各大药店及药材市场，经江西中医药大学张文惠教授鉴定均为丹参药材。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱:Waters C18色谱柱(150mm ×3.9mm，5μm);以乙腈为流动相A，0.3%甲酸-水溶液为流动相B，梯度洗脱0～10min 20%B～28%B，10～18min 28%B～35%B，18～22min 35%B～65%B。22～30min 65%B～65%B;流速为1mL/min;柱温:30℃;进样量10μL;丹酚酸B和丹参酮ⅡA的检测波长分别为286nm、270nm。

2.2 供试品溶液制备

取丹参粉末(过三号筛)0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50mL，称定重量，80℃加热回流1h，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用75%甲醇稀释10倍，过0.22μm滤膜，即得。

2.3 对照品溶液制备

精密称取丹酚酸B、丹参酮ⅡA对照品适量，加甲醇溶解定容后，逐级稀释成5组不同浓度的混标溶液，其中丹酚酸 B 的浓度依次为 0.35、0.175、0.035、0.007、0.0014mg/mL;丹参酮 Ⅱ A 的浓度依次为 0.12、0.06、0.012、0.0024、0.00048mg/mL，该 5 组混标溶液作为对照品溶液备用。

2.4 线性关系考察

精密吸取不同浓度的对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，色谱如图1所示，分别记录丹酚酸B、丹参酮ⅡA的峰面积，以对照品溶液浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归分析。结果表明丹酚酸B在0.014～3.5mg范围内，峰面积具有良好的线性关系，其回归方程为:Y=4350.9X －5.714，R2=0.9996;丹参酮ⅡA 在 0.0048～1.2mg范围内，具有良好的线性关系，其回归方程为:Y=44744X －6.9782，R2=0.9999。

图1 对照品溶液的HPLC图谱

2.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液10μL，在“2.1”项色谱条件下，连续进样5次，分别记录各化合物的峰面积，丹酚酸B峰面积的RSD为0.82%，丹参酮ⅡA为1.07%。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别在0、3、6、9、12、24h 记录丹酚酸 B、丹参酮ⅡA 的峰面积，两种化合物峰面积的RSD均小于1.5%，说明样品溶液在24h内稳定性良好。

图2 丹参提取液的HPLC图谱

2.7 重复性试验

精密称取同一批样品5份，置具塞锥形瓶中，精密称定，按“2.2”项供试品溶液的制备方法制备，在“2.1”项色谱条件下测定，记录丹酚酸B、丹参酮ⅡA的峰面积，代入标准曲线中计算含量，丹酚酸B的平均含量为49.89mg/g，RSD为3.16%;丹参酮ⅡA 的平均含量为 5.27mg/g，RSD为3.46%。