酶法提取苦豆草生物碱研究

李 军，郝彩琴，陈海燕，郭鸿雁，冷晓红（宁夏职业技术学院，宁夏中药材开发与利用工程技术研究中心，银川 750021）

苦豆子（Sophora alopecuroides L.）又称苦甘草、苦豆根，隶属于豆科槐属，为多年生草本、根茎地下芽植物，苦豆子药材主要以全草、种子供药用，习惯上将苦豆子花期的干燥地上部分作为“苦豆草”［1］；主产于宁夏、内蒙古、山西、陕西、甘肃等地区［2］。苦豆子生物碱的药理作用主要有镇静催眠、镇痛及降温、抗心律失常、降血脂、抗病毒、抗炎及免疫抑制作用等［3－4］。临床应用的有克泻灵片，治疗菌痢、结肠炎和急慢性肠炎；苦参素注射液和苦参素胶囊，可治疗慢性乙型病毒性肝炎等［5］。

目前，苦豆草中生物碱的提取方法种类繁多，要进行工业化放大却存在提取率偏低、设备昂贵、投资大、提取时间长等缺点，而酶法提取不需要更换和新增设备，只是在工艺上加以改进就可提高生物碱的提取率［6－7］。为此，笔者在实验室酶法提取的基础上，利用多功能提取浓缩机组对小试相关工艺参数进行优化筛选，并对影响产品质量和生产成本的相关环节进行考察，找到了一种方法可行、提取效果佳的小试提取工艺，为其进一步的中试放大及工业化生产提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 DT－30动态多功能提取浓缩机组（杭州春化自动化研究所）；FQ－120往复式切药机（山东青州精诚制药设备有限公司）；TU－1810紫外分光光度计（北京普析通用分析仪器有限公司）；ACS－8电子天平（上海旺丰衡器有限公司）。

1.2 试药 苦豆草（采于盐池县花马池镇德胜墩自然村等地），经鉴定为豆科槐属植物苦豆子（Sophora alopecuroides L.）的花期干燥地上部分，切段备用；纤维素酶（150 000U·g－1）购于宁夏和氏璧生物有限公司；浓盐酸为国产化学纯；其他化学试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 苦豆草提取物含量测定 苦豆草总生物碱含20多种单体，其中以槐定碱的含量最高，参考相关文献［8］，采用溴麝香草酚蓝比色法以槐定碱为指标成分测定苦豆草总生物碱含量（λ＝410nm）。具体方法如下：

2.1.1 标准曲线的制作 精密称定槐定碱对照品5.10mg，置于5mL量瓶中，加无水乙醇溶解定容即得槐定碱对照品溶液。取上述溶液0，20，40，60，80，100，120和140μL，分别置于50mL的磨口锥形瓶中，挥尽乙醇，加溴麝香草酚蓝pH＝7.6缓冲液12mL、氯仿12mL，密塞剧烈振摇2min，静置2h后分出氯仿层，以第一个为空白，于410nm处测定对照品溶液的吸光度，以吸光度为横坐标、氯仿层生物碱质量浓度为纵坐标，进行回归，得回归方程：A＝0.012 75C－0.005 71，r＝0.999 8。

2.1.2 样品含量测定 分别吸取提取液1mL，稀释至10mL，吸取0.2mL，置于锥形瓶中，加入溴麝香草酚蓝pH 7.6缓冲液12mL、氯仿12mL，密塞振摇2min，静置2h，分取氯仿层，以对应的提取溶剂0.2mL、溴麝香草酚蓝pH7.6缓冲液12mL和氯仿12mL同比操作为空白，于410nm处测定提取液的吸光度A，从制作的标准曲线中查得相应的生物碱质量浓度，并计算出苦豆草总生物碱的含量。

2.1.3 精密度实验 取同一批次提取的苦豆草提取物，按照2.1.2项下方法操作，平行测定5次吸光度值，计算RSD。

2.1.4 稳定性实验 取同一批次提取的苦豆草提取物，按照2.1.2项下方法操作，每隔30min于410nm波长处测定吸光度，计算RSD。

2.1.5 重复性实验 取同一批次提取的苦豆草提取物，按2.1.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按上述条件测定吸光度，计算RSD。

2.1.6 回收率实验 取已知含量的苦豆草提取物0.25mL6份，分别加入1.02mg·mL－1对照品溶液25μL，按2.1.2项下方法制备和测定含量，计算回收率。

2.2 不同提取方法对生物碱提取率的影响 小试规模下，比较传统提取和酶法提取苦豆草生物碱的提取率，具体步骤如下：前者是先称取1kg经粉碎的苦豆草段，加入4mL·L－1盐酸（料液比1∶16），加热至95℃回流提取4h，滤过，收集滤液，按2.1.2项下方法进行含量测定。后者是称取1kg经粉碎的苦豆草段，加水适量，同时加入纤维素酶（1∶1 000），加热至50℃，保温酶解4h，后加入盐酸至浓度为4mL·L－1，料液比为1∶16，加热至95℃回流提取4h，滤过，收集滤液按2.1.2项下方法进行含量测定。

2.3 酶法提取小试工艺条件的优化 在实验室提取实验中，已经优化出苦豆草生物碱酶法提取的最适条件为：酶解时间4h，溶剂pH＝6，温度为50℃，加酶量为1∶1 000，酶解后，加入盐酸至浓度为4mL·L－1，料液比为1∶20，提取4h。苦豆草生物碱的提取率可达2.24%。在此工作的基础上，本研究利用小试生产规模的提取罐进行实验，在酶解参数不变的条件下，考察了提取次数、料液比、提取时间对提取率的影响，筛选出最优的小试工艺条件。

3 结果与分析

3.1 苦豆草提取物含量测定方法学考察

3.1.1 精密度实验 取同一批次提取的苦豆草提取物，按照2.1.2项下方法操作，平行测定5次吸光度值，5次测定结果的RSD为0.208%，说明仪器精密度良好。

3.1.2 稳定性实验 取同一批次提取的苦豆草提取物，按照2.1.2项下方法操作，每隔30min于410nm波长处测定吸光度，RSD为1.42%，结果表明样品溶液在120min内测定稳定。

3.1.3 重复性实验 取同一批次提取的苦豆草提取物，按照2.1.2项下方法平行制备6份样品溶液，按上述条件测定吸光度，6次测定结果的RSD为0.488%，说明方法重复性较好。

3.1.4 回收率实验 取已知含量的苦豆草提取物0.25mL 6份，后各加入1.02mg·mL－1槐定碱对照品溶液25μL，按2.1.2项下方法制备和测定含量，计算回收率，结果6次测定的回收率平均值为98.51%，RSD为1.99%，说明方法的准确性较好。详见表1。

表1 回收率测定结果Tab.1 The experiment results of recovery

3.2 小试提取工艺条件的优化

3.2.1 不同提取方法对生物碱提取率的影响 通过比较苦豆草传统提取和酶法提取2种方法，传统提取法的提取率为1.46%，而酶法提取的提取率为1.76%，后者较大程度地提高了苦豆子生物碱的提取率，比煎煮提取法提高了26%。

3.2.2 不同提取次数对生物碱提取率的影响 通过对不同提取次数对苦豆草生物碱提取率的实验，第1次提取的提取率为1.58%，第2次提取的提取率为0.36%，第3次提取的提取率只有0.08%，表明经过2次提取后，苦豆草中的生物碱已基本转移到溶剂中，考虑综合成本，以下实验选择提取2次。

3.2.3 料液比对生物碱提取率的影响 对1∶10，1∶12和1∶16不同料液比进行生物碱提取率的实验，结果显示，随着料液比的增加，苦豆草生物碱的提取率在不断增加，当达到1∶16时，提取率最高达到2.08%。故以下实验选择料液比1∶16。

3.2.4 不同提取时间对生物碱提取率的影响 在第1次提取生物碱时，生物碱的提取率在提取2h时已经达到1.82%，而后随着时间的延长基本没有增加，反而呈下降趋势，故第1次提取选择提取2h。而第2次提取1h的生物碱提取率为0.35%，高于提取2h的。故第2次提取选1h。2次提取得出苦豆草生物碱的总提取率为2.17%。

4 讨论

从植物中提取有效成分的首要条件是破坏细胞壁，使有效成分快速高效地进入提取溶剂，而大多数植物的有效成分存在于细胞内，因此提取的关键是如何有效地打破细胞壁这层壁垒［9］。而纤维素是植物细胞壁的主要成分，亦是胞内大分子溶出的主要屏障，纤维素酶可使纤维素降解为小分子物质，利于胞内成分溶出［10］，因此添加纤维素酶使苦豆草生物碱的提取率有了较大的提高，由原来的1.46%提高到了2.17%。

本研究在实验室酶法提取的基础上进行了小试生产条件优化，按照实验室酶法提取条件放大后进行小试，苦豆草生物碱的提取率仅为1.76%，与实验室酶法提取中提取率2.24%有一定差距，可能是由于热量传导、传质等实验条件的改变所致。故对小试生产中的料液比、提取时间、提取次数进行了优化，确定了小规模生产的工艺路线为：酶解时间4h，溶剂pH＝6，温度为50℃，加酶量为1∶1 000，酶解后，加入盐酸至浓度为4mL·L－1，料液比1∶16，提取2次，第1次2h，第2次1h。该工艺条件较实验室提取时，料液比由原来的1∶24改为1∶16，更符合工业生产实际，酶解后酸提的时间由原来的4h缩短为3h，而提取率基本与实验室提取时接近［11］，提高了生产效率。

本研究开展的纤维素酶法提取小试工艺是药品从研发到生产的必由之路，也是降低产业化实施风险的有效措施，是联结中试放大和产业化生产的桥梁，可为产业化生产积累必要的经验和实验数据，具有重要意义。但其工艺参数需要在后续的中试工艺中进行验证，可根据实际情况进行微调，最终确定具体可行的工艺参数［12］，为将其用于苦豆草生物碱的提取和后期的工业化生产奠定基础。

［1］陈海燕，郭鸿雁，冷晓红.HPLC法测定西北地区不同产地苦豆子药材中生物碱的含量［J］.北方药学，2013，10（5）：10－11.

［2］李珂璟，王小龙.苦豆子及其利用［J］.甘肃农业科技，2010，（2）：46－47.

［3］廖春燕，梁健，杨燕，等.苦豆子的药理及应用概述［J］.中国民族民间医药，2009，18（3）：6－8.

［4］刘军锋，丁泽，欧阳艳，等.苦豆子生物碱抗菌活性的测定［J］.北京化工大学学报：自然科学版，2011，38（2）：84－88.

［5］杨巧丽，顾政一，黄华.中药苦豆子的研究进展［J］.西北药学杂志，2011，26（3）：232－235.

［6］邓志勇.纤维素酶法提取叶下珠总生物碱的工艺研究［J］.食品工业，2013，34（3）：159－161.

［7］陈晓琳，张岩柏，邓振雪.酶法提取白英中总生物碱的工 艺研 究 ［J］.西 北 药 学 杂 志，2012，27（4）：291－293.

［8］李军，冷晓红，郝彩琴.苦豆草生物碱提取方法的研究［J］.安徽农学通报，2010，16（17）：47－48.

［9］王瑾，王宫，林海，等.复合酶法提取长春碱的中试工艺研究［J］.现代中药研究与实践，2010，24（4）：44－46.

［10］晁红娟，高荫榆，丁红秀，等.酶法中试提取毛竹叶柄中多糖和类黄酮的研究［J］.食品科学，2007，2（12）：208－211.

［11］周锦珂，曾荣华，李金华，等.吴茱萸药材中吴茱萸碱及吴茱萸次碱的超声提取中试研究［J］.中药材，2008，31（8）：1247－1248.

［12］张永太，修彦凤，陶建生，等.黄芪、丹参、三七中多糖提取工艺考察［J］.中国中医药信息杂志，2011，18（11）：65－67.