喉鳞癌中扭曲基因、上皮型钙黏附蛋白和神经型钙黏附蛋白基因表达及相关研究

朱艳艳 俞建平 赵瑞力

扭曲基因(Twist)是一种在胚胎发生中起关键调控作用的转录因子，有癌基因特征，能编码程序性细胞死亡抑制蛋白和介导上皮-间质转化(epithelialmesenchymal transition，EMT)，从而促进肿瘤侵袭和转移［1］。EMT是指上皮细胞在形态学上发生成纤维细胞或间充质细胞表型的转变并获得迁移的能力，多发生在胚胎发育早期及癌转移的过程中［2］。EMT发生时常伴有上皮型钙黏附蛋白(E-cadherin)表达下降及神经型钙黏附蛋白(N-cadherin)升高。本实验采用免疫组织化学SP法及反转录聚合酶链反应(reverse transcriptional polymerase chain reaction，RT-PCR)方法检测 Twist在喉鳞癌(laryngealsquamouscell carcinoma，LSCC)及癌旁组织中的表达，并探讨Twist与E-cadherin、N-cadherin在LSCC的发生、发展及浸润转移中的作用及相关性。

1 材料与方法

1.1 标本 取自河北医科大学第四医院2008年2月～2009年12月耳鼻喉科的喉癌标本，一部分液氮保存用于RNA的提取;另一部分10%甲醛固定用于免疫组织化学。癌旁组织共20例(距癌组织切缘＞0.5 cm，经病理证实为炎症或正常黏膜)，喉癌标本共49例，均病理证实为鳞癌，其中男性47例、女性2例;高分化(G1)17例、中分化(G2)21例、低分化(G3)11例;有淋巴结转移(N+)15例，无淋巴结转移(N0)34例;临床分期采用国际抗癌协会(UICC)2001年公布的TNM分类分期标准Ⅰ、Ⅱ期18例，Ⅲ、Ⅳ期31例;声门上型33例，声门型16例。年龄36～75岁，中位年龄60岁。全部患者术前均未接受放化疗，临床资料完整。

1.2 试剂与方法

1.2.1 免疫组织化学 Twist鼠单克隆抗体:sc-81417 Santa Cruz Biotechnology Inc，E-cadherin鼠单克隆抗体:Gene Tech (Shanghai)Company Limited，N-cadherin鼠单克隆抗体:ZM-0094北京中衫金桥生物技术有限公司。鼠二抗免疫组织化学试剂盒:SP-9002北京中衫金桥生物技术有限公司。DAB显色液:ZLI-9032北京中杉金桥生物技术有限公司。采用免疫组织化学SP法，Twist、E-cadherin采用EDTA缓冲工作液进行抗原修复，N-cadherin采用枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复，均用高压热修复预处理。PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性组织切片(乳腺癌)作为阳性对照。

1.2.2 RT-PCR 组织总 RNA提取试剂TRIzol(SBS Corporation，美国);总 RNA提取试剂(total RNA isolation reagent，Promega Corporation，美国);反转录PCR试剂盒 M-MLV反转录试剂盒 (Promega Corporation，美国);DNA MarkerⅠ II北京Solarbio科学技术有限公司;绿色体系 (Promega Corporation，美国)。提取 RNA后取6 μL经反转录成 cDNA后行PCR。引物合成引自文献［3］，PCR引物序列及反应条件见表1。将扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统分析并拍摄。

1.3 统计学处理 用SPSS13.0统计软件分析。免疫组织化学结果采用χ2检验，mRNA数据以表示，两组间的比较采用 t检验;相关性分析用Spearman等级相关分析和直线相关分析。采用双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 PCR引物及反应条件

2 结果

2.1 免疫组织化学结果(图1～4及表2)Twist蛋白表达呈棕褐色，定位于细胞质及细胞核，以细胞质为主，以出现片状或颗粒状的胞质或胞核着色为阳性细胞(图1);Twist在喉癌旁组织中表达为阴性(图2)。N-cadherin阳性表达以胞质着色为主 (图3)，呈明显的棕黄色颗粒。采用半定量记分法，随机选取5个高倍视野(×400)，按阳性着色程度评分:0分为无着色;1分为浅黄色;2分为棕黄色;3分为棕褐色。再按阳性细胞所占比例评分:0分为阴性;1分为＜10%;2分为11%～50%;3分为51%～75%;4分为＞75%;以两者乘积判定结果:4～12分定为阳性，4分以下定为阴性。E-cadherin阳性表达以胞膜着色为主(图4)，呈棕黄色颗粒状或线状，以出现均匀完整的胞膜着色定为阳性细胞。参照Fromowitz评分标准，随机选取5个高倍视野(×400)计数肿瘤细胞总数和阳性细胞数，得出阳性细胞百分率，其中阳性细胞率≤25%为0分，26% ～50%为1分，51% ～75%为2分，＞75%为3分;再按多数阳性细胞呈现的染色强度予以记分:无显色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将上述2项得分相加:0分判为“-”，1～2分判为“+”，3～4分判为“++”，5～6分判为“+++”。E-cadherin以“++”和“+++”为正常表达，＞10%细胞出现胞质和(或)核表达定义为“-”。“-”、“+”皆归为异常表达。

图1.Twist在喉癌组织中的表达

图2.Twist在喉癌旁组织中的表达

图3.N-cadherin在喉癌组织中的表达

图4.E-cadherin在喉癌组织中的表达

表2 Twist，E-cadherin，N-cadherin 在喉癌组织中的蛋白表达和临床参数间的关系

Twist蛋白阳性在喉癌组织中的阳性表达率61.22%(30/49)明显高于癌旁组织的25%(5/20)，差异有统计学意义(P＜0.01);在喉鳞癌中，Twist的蛋白表达与淋巴结转移(N+组高于N0组，P＜0.05)、临床分期(Ⅲ、Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期，P＜0.01)相关，与肿瘤病理学分级、临床分型及年龄分组无关(P＞0.05)。E-cadherin在喉癌组织中的阳性表达率51.02%(25/49)明显低于癌旁组织的100.00%(20/20)，差异有统计学意义(P＜0.01);在喉癌中，E-cadherin的表达与肿瘤病理学分级(G1、G2组高于 G3组，P ＜0.05)、淋巴结转移(N0组高于 N+组，P ＜0.01)和临床分期(Ⅰ、Ⅱ期高于Ⅲ、Ⅳ期，P＜0.01)相关，而与临床分型及年龄分组无关(P＞0.05)。N-cadherin在喉癌组织中的阳性表达率73.47%(36/49)明显高于癌旁组织的 40.00%(8/20)，差异有统计学意义(P＜0.05);在喉鳞癌中，N-cadherin蛋白表达与淋巴结转移(N+组高于N0组，P＜0.05)、临床分期(Ⅲ、Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期，P ＜0.01)及年龄分组(≤60岁组高于＞60岁组，P＜0.05)相关，而与肿瘤病理学分级及临床分型分组无关(P＞0.05)。

2.2 RT-PCR结果 (见图5-7及表3)

图5.Twist mRNA在喉癌组织和癌旁组织中的表达

图6.E-cadherin mRNA在喉癌组织和癌旁组织中的表达

图7.N-cadherin mRNA在喉癌组织和癌旁组织中的表达

表3 Twist，E-cadherin，N-cadherin在喉癌组织中的mRNA表达和临床参数间的关系

Twist在喉鳞癌组织中 mRNA的相对表达量(0.93 ±0.39)明显高于癌旁组织(0.57 ±0.24)，差异有统计学意义(P＜0.01);Twist mRNA的表达与淋巴结转移(N+组高于N0组，P ＜0.05)、临床分期(Ⅲ、Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期，P＜0.01)相关，与肿瘤病理学分级、临床分型及年龄分组无关(P＞0.05)。E-cadherin在喉癌组织中的mRNA相对表达量(0.64±0.30)低于癌旁组织(0.93±0.33)，差异有统计学意义(P＜0.01);在喉鳞癌中，E-cadherin的mRNA表达与肿瘤病理学分级(G1、G2组高于 G3组，P ＜0.01)、淋巴结转移(N0组高于 N+组，P＜0.01)和临床分期(Ⅰ、Ⅱ期高于Ⅲ、Ⅳ期，P＜0.05)相关，与临床分型及年龄分组无关(P＞0.05)。N-cadherin在喉癌组织中的mRNA相对表达量(0.70 ±0.21)高于癌旁组织(0.36 ±0.11)，差异有统计学意义(P＜0.01);喉鳞癌中，N-cadherin的mRNA表达与淋巴结转移(N+组高于 N0组，P＜0.05)、临床分期(Ⅲ、Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期，P ＜0.01)相关，与肿瘤病理学分级、临床分型、年龄分组无关(P＞0.05)。

2.3 3种基因mRNA及蛋白表达相关性 在mRNA水平及蛋白水平，Twist与 E-cadherin(r=-0.760，P ＜0.01;r=-0.662，P ＜ 0.01)，N-cadherin 与 E-cadherin(r=-0.615，P ＜0.01;r=-0.558，P ＜0.01)的表达均呈负相关;Twist与N-cadherin均呈正相关(r=0.850，P ＜0.01;r=0.649，P ＜0.01)。

3 讨论

Twist属于螺-环-螺(basic helix-loop-helix，bHLH)转录因子家族，可调节胚胎发育过程中的细胞重建，并赋予细胞迁移的能力。2004年Yang等［4］在小鼠乳腺癌肺转移模型中发现Twist的重要作用，体外实验证实了Twist与EMT现象及肿瘤转移的相关性，从而引发了人们对于肿瘤中Twist作用的关注。

本实验发现无论在mRNA还是在蛋白水平，Twist在喉癌组织的表达都比癌旁组织明显升高，表明Twist可能参与喉癌的发生，其原因可能是Twist能够抑制细胞凋亡。Twist通过抑制P53蛋白活性，影响P53介导的凋亡通路来抑制凋亡的机制已被证实［5］。另外，Twist还可通过对Akt途径的正性调控作用抑制凋亡。有研究发现，以RNA干扰技术沉默Twist基因后可增强紫杉醇诱导的鼻咽癌细胞凋亡。目前已在多种人类上皮来源肿瘤中发现Twist表达增高，并与患者预后关系密切，如子宫颈癌［6］、乳腺癌［7］等，而在喉癌组织中的研究国内还少见相关报道。

本实验对Twist在喉癌组织中的mRNA和蛋白的表达和临床各参数之间的关系进行研究发现，Twist的表达率在有淋巴结转移组的高于无淋巴结转移组，临床分期Ⅲ、Ⅳ期组高于Ⅰ、Ⅱ期组，差异有统计学意义，提示Twist在喉癌的浸润转移过程中也起重要作用。这与Song等［8］关于Twist表达与淋巴结转移相关性的研究结果一致。Yuen等［9］发现Twist胞核内表达对原发前列腺癌转移潜能的判断有意义。我们在实验中也发现Twist在核表达呈强阳性的3例标本中均伴有淋巴结转移，提示Twist在胞核内表达增高也可能对喉癌转移潜能的判断有意义，但因本实验Twist在核表达为强阳性的样本数较少，尚无统计学意义。Ou等［10］对50例头颈部鳞癌组织进行免疫组织化学分析，证实Twist阳性表达和肿瘤分化程度、淋巴结转移以及疾病进展密切相关，但准确的调节机制需进一步研究。

E-cadherin及N-cadherin是钙黏附分子家族中与肿瘤转移关系最密切的2种，本实验发现虽然E-cadherin在喉癌和癌旁组织中均有表达，但E-cadherin在喉癌中不仅表达减少，且以胞质表达为主，胞膜表达不明显。这可能是因为此时E-cadherin虽有合成，但不能良好表达于细胞膜，发挥应有的黏附作用。对喉癌组织中E-cadherin的表达与喉癌临床参数的关系分析发现，无论mRNA还是蛋白的表达都与肿瘤病理学分级、颈部淋巴结转移及临床分期相关，均提示E-cadherin表达下调或缺失参与了喉癌的发生、发展、浸润和转移。

本实验对N-cadherin表达研究发现，在蛋白和mRNA水平喉癌中都较癌旁组织升高，并与肿瘤分化程度、淋巴结转移和临床分期相关。实验中还发现N-cadherin的蛋白表达与年龄相关，但mRNA与年龄无关，以往并无证据表明N-cadherin的蛋白表达与年龄相关，故推断可能是由于统计中的抽样误差造成，该结论需进一步验证。有研究显示，N-cadherin在胞核或胞质中高表达可引起癌基因c-erbB1的蛋白表达产物EGFR作用持续增强。当EGF与之结合后可刺激细胞分裂和增殖，从而促进某些肿瘤形成。N-cadherin的高表达还可以激活MAPK信号转导系统，诱导MMP-9基因表达，促进肿瘤血管形成，使肿瘤易于生长和转移。

本实验发现在mRNA和蛋白水平上都存在Twist和 E-cadherin负相关，Twist与 N-cadherin正相关，E-cadherin和N-cadherin负相关。Twist通过调控EMT来促进肿瘤的浸润和转移已在乳腺癌［11］、甲状旁腺癌［12］等多种肿瘤中被证实。EMT的特征是上皮性标记丢失如 E-cadherin，而获得间质细胞的标记如N-cadherin，vimetin，smooth muscle actin。一些基因如Twist，snail，sip1，slug 等能够诱导 EMT，其共同特征是含有靶基因启动子上的E-box基因序列的DNA结合序列。

但在Twist高表达的狗肾内皮细胞中转入并表达E-cadherin并不能诱导EMT的逆转［4］，说明Twist的作用机制绝非仅仅是抑制E-cadherin，可能涉及其他基因和细胞因子。Huber等［13］发现 Twist既可直接与E-cadherin启动子区的E-box结合，从转录水平上抑制E-cadherin的表达，又可通过非转录调节使细胞黏着蛋白和纤连蛋白表达增高来增加肿瘤细胞侵袭力。在胚胎发育过程中，Twist能促进 N-cadherin的表达，N-cadherin的增加进一步导致E-cadherin的表达下降;而N-cadherin在细胞间的连接作用要明显低于E-cadherin，所以当N-cadherin的表达增高后，肿瘤细胞的能力就会明显提高。以上均提示Twist可能通过上调N-cadherin和下调E-cadherin介导EMT发生，从而参与喉癌的发生、发展、浸润和转移。3种基因的联合检测可较好反映肿瘤的浸润和转移等生物学行为，为指导临床治疗和肿瘤基因治疗提供重要的临床参考价值。

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