Bac-to-Bac/BmNPV杆状病毒在家蚕幼虫中表达重组鲎C因子

祁静，刘涛，李珍，贡成良，吴海苹，张春

1 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 苏州市分子诊断与治疗技术重点实验室，江苏 苏州 215163

2 苏州大学基础医学与生命科学学院，江苏 苏州 215006

3 厦门市鲎试剂实验厂有限公司，福建 厦门 361022

内毒素又称之“热原”，其主要成分为脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)。热原进入人体内后可导致发热、休克甚至死亡，因而内毒素检测是药厂制药和医疗设备制造中必须的一道程序[1-2]。鲎试剂 (Limulus Amebocyte Lysate,LAL/Tachypleus Amebocyte Lysate, TAL)是国际上至今为止检测内毒素的金标准，具有简单、快速、灵敏度高等特点。然而鲎数量有限，鲎血中 G因子干扰以及鲎试剂批次间不均一性等局限性，迫切需要开发鲎试剂的替代品[3-5]。

鲎C因子 (Factor C)是鲎血细胞中对LPS具有高亲和力的一种丝氨酸蛋白酶，LPS激活Factor C后，活化的C因子能起始鲎血细胞中的凝集反应，并且其丝氨酸酶活性可以切割含精氨酸 (Arg)的三肽底物[6-7]。早期有研究人员在不同的表达系统中表达过鲎C因子，并证实该蛋白在昆虫细胞中表达时具有完全的生物学功能[8-11]。

杆状病毒表达系统具有高效表达，安全性好，表达产物稳定，后加工修饰等优点[12]，与细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统并列为公认的基因工程 4大表达系统[13]。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 (Autographa califormica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV)和家蚕杆状病毒 (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)是最常用的两类杆状病毒表达载体。前者利用无血清培养基在昆虫细胞中表达蛋白，可用于生产和纯化分泌蛋白[14-15]。后者利用家蚕生物反应器表达重组蛋白，相比前者具有表达产量高、成本低、易形成自主产业等特点[16-18]。Wang等[11]利用AcNPV在草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda 卵巢细胞系Sf9细胞中表达Factor C，可用于检测内毒素，其反应原理如图1所示。

图1 重组Factor C检测内毒素原理图Fig. 1 Endotoxin detection mechanism of recombinant Factor C.

Bac-to-Bac/BmNPV杆状病毒表达系统是2005年由 Motohashi等[19]首次建立的，相比传统的BmNPV表达系统，生产重组蛋白的周期大大缩短[20]。本研究利用该系统表达鲎C因子，并分析表达产物的生物学活性，旨在为开发低成本新型内毒素检测试剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体、菌株和细胞

pFastBacHTb载体、大肠杆菌 (E. coli)DH5α由本实验室保存。E. coli BmDH10Bac[21]、家蚕细胞系 BmN和家蚕品种青松×皓月由苏州大学基础医学与生命科学学院贡成良实验室保存。东方鲎血细胞由厦门鲎试剂厂馈赠。

1.1.2 试剂和酶

RT逆转录试剂盒、限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自Fermentas公司。KOD-plus-neo DNA聚合酶购自TOYOBO公司。Trizol试剂、Grace细胞培养基、胎牛血清、cellfectinⅡReagent均购自Gibco公司。荧光底物购自 Sigma公司。引物由上海生工有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 重组pFastbacHTb-Factor C载体的构建

用 trizol试剂提取东方鲎血细胞中的总RNA, 逆转录成cDNA。设计一对特异性引物扩增factor C基因片段 (P1和P2，见表1)。并且在上下游引物 5′末端分别引入 XbaⅠ和 KpnⅠ酶切位点。PCR扩增条件为94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，59.5 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，35个循环。PCR产物用 1%琼脂糖电泳，胶回收。用 XbaⅠ和 KpnⅠ双酶切胶回收产物和pFastbacHTb载体，纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化DH5α感受态，挑取转化子经37 ℃过夜培养后抽提质粒，酶切鉴定并测序。

1.2.2 重组bacmid-Factor C的构建

将测序正确的pFastbacHTb-Factor C质粒转化含有bacmid和helper质粒的BmDH10Bac感受态，蓝白斑筛选出阳性克隆，抽提重组bacmid，用M13通用引物PCR鉴定 (P3和P4，见表1)。

1.2.3 重组杆状病毒的获取

将鉴定正确的bacmid-Factor C用cellfectinⅡReagent转染六孔板中的BmN细胞，细胞密度为60%–70%，120 h后收集培养上清，1 000 r/min离心5 min，得到的上清即为P1。取P1按MOI值0.1连续感染BMN细胞两次后获得高滴度的P3病毒。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.4 杆状病毒表达Factor C的鉴定

取MOI 1、5、10感染六孔板中的BMN细胞，48、72 h后收集细胞，1 000 r/min离心，用无内毒素水洗两遍。细胞沉淀裂解后，上清用于SDS-PAGE和Western blotting检测。浓度胶浓度 5%，分离胶浓度 10%。一抗为小鼠抗6×His单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的抗体。

1.2.5 重组Factor C在家蚕幼虫中的表达

参照Yue等[22]报道的方法，2 μL P3野生型(Wild)病毒和重组 Factor C病毒 (108pfu/mL)皮下注射到五龄第 1天家蚕体内，当家蚕出现典型的病变特征后每天收集家蚕血清，4 000 r/min、4 ℃离心 5 min，上清冻于–20 ℃。

1.2.6 重组Factor C的活性鉴定

参照Ding等[23]报道的方法，家蚕血清用无内毒素水稀释100、500、1 000倍，利用动态荧光法检测重组Factor C活性。在无内毒素的96孔板中依次加入LPS (0–10 EU/mL)，0.01%吐温20，稀释的蚕血，75 μmol/L荧光底物Boc-Val-Pro-Arg-MCA，总体积 200 μL。设定酶标仪的反应温度为37 ℃，激发波长360 nm，发射波长460 nm，检测荧光信号。每个浓度做3个复孔，设置阴性对照2个。

2 结果

2.1 重组pFastbacHTb-Factor C载体的构建

图2 Factor C基因的克隆和pFastbacHTb-Factor C的构建Fig. 2 Cloning of factor C and construction of pFastbacHTb-Factor C. (A)RT-PCR cloning of factor C. M: DNA marker DS 5 000; 1: PCR fragment of factor C. (B)Identification of pFastbacHTb-Factor C by restrictive enzyme digestion. M: DNA marker DS 5 000; 1: pFastbacHTb-factor C digested with XbaⅠ/Kpn I.

东方鲎factor C基因全长3 060 bp，编码1 019个氨基酸。以逆转录的cDNA为PCR模板扩增目的基因。琼脂糖凝胶电泳显示目的基因的大小在3 000 bp附近 (图2A)。factor C基因通过XbaⅠ和KpnⅠ插入到pFastbacHTb载体中，转化后抽提质粒双酶切鉴定，可切下4.8 kb和3 kb左右预期大小的条带 (图2B)。酶切鉴定正确的质粒送去测序，与GenBank中已报道的东方鲎factor C基因序列 (D90271)比对，显示仅仅编码的第 823个氨基酸不一样，但与同一亚科的圆尾鲎 factor C基因序列该位点的氨基酸一致 (S77063)，说明得到的基因序列是正确的。

2.2 重组bacmid-Factor C的鉴定

以野生型bacmid和重组bacmid-Factor C为模板，M13上下游引物做PCR扩增，鉴定重组杆状病毒 DNA。结果显示，野生型 bacmid在250 bp附近有目的条带(图3A)，与预期的300 bp一致。重组bacmid在5 000–6 000 bp之间有目的条带 (图3B)，与预计的5 500 bp结果一致。

2.3 重组杆状病毒的获取

图3 PCR鉴定重组bacimdFig. 3 Identification of recombinant bacmid by PCR.(A)M: DNA marker DS 5 000; 1: wild bacmid. (B)M:1 kb DNA marker; 1: recombinant bacmid.

重组bacmid转染BmN细胞后，72 h后可以观察到明显的病变，表现在细胞停止生长，形状由梭形变成圆形。120 h大部分细胞飘起来，并裂解 (图 4)。此时可以收集到成熟的杆状毒P1。

2.4 重组Factor C在BmN细胞中的表达

用抗his标签的单克隆抗体检测BmN细胞中表达的重组Factor C，同时用未感染的BmN细胞和野生型病毒感染的BmN细胞作对照。结果显示，相比对照，重组病毒感染的BmN细胞在100 kDa处有预期大小的条带 (图5)。

图4 正常细胞和bacmid转染后的细胞Fig. 4 Normal BMN and BMN cells transfected with bacmid. (A)Normal BMN cells. (B)BMN cells transfected with recombinant bacmid after 120 h.

图5 抗 His标签单抗对重组 rFC的 Western blotting检测Fig. 5 Identification of rFC expressed in BmN cells by Western blotting using anti-his-tag antibody. M:PageRuler TM prestained protein ladder; 1: normal BmN cells; 2: BmN cells infected by wild virus; 3: BmN cells infected with recombinant virus.

2.5 重组Factor C在家蚕幼虫中的表达

杆状病毒注射到家蚕幼虫后，72 h后家蚕出现典型的感染症状，即食欲下降，生长缓慢,并出现身体肿胀，关节处最为明显 (图6)。144 h后感染的家蚕幼虫陆续开始死亡。收集72、96、120、144 h的家蚕血清，用于后续Factor C的活性测定。

2.6 重组Factor C的活性鉴定

图6 正常家蚕幼虫和病毒感染后的家蚕幼虫Fig. 6 Normal silkworm larvae and infected silkworm larvae. (A)Normal silkworm larvae. (B)Silkworm larvae infected by recombinant virus after 72 h.

取病毒感染的家蚕血清稀释 100、500、1 000倍，测定其中Factor C的活性。结果显示5 d时收集的蚕血稀释500倍时检测的信噪比较高,且灵敏度较高 (表 2)。取病毒感染 5 d后的家蚕血清做500倍稀释，内毒素梯度为0.2、0.5、1、2、5、10 EU/mL，动态荧光法检测Factor C活性。结果显示，随着内毒素浓度的增加以及反应时间的延长，检测到的荧光信号增强(图7A)。以内毒素浓度和荧光强度做标准曲线，R2值为0.997，因而表达的重组Factor C可以用来检测内毒素，且灵敏度达到了 0.2 EU/mL(图 7B)。

3 讨论

重组鲎C因子具有LPS结合活性和丝氨酸蛋白酶活性，因而可作为新型内毒素检测试剂，解决鲎数量有限，鲎血中G因子旁路干扰[24]，鲎试剂各批次不稳定性的缺点。早期有研究者在细菌，酵母中表达重组 C因子，均不能得到有丝氨酸酶活性的蛋白,后证实该重组蛋白在昆虫细胞中表达后具有完整的生物学活性[11]。昆虫表达系统具有容量大、周期短、表达量高、翻译后加工等优点。Ding等[25]在昆虫细胞 sf9中表达了重组C因子，用培养上清检测内毒素，灵敏度可到0.01 EU/mL，达到了高灵敏度的鲎试剂检测水平 (0.06–0.015 EU/mL)。但利用该方法产业化生产试剂，需要无血清，悬浮培养大量细胞，成本较高。Usami等[26]比较了多种重组蛋白在昆虫细胞 sf9和家蚕幼虫中的表达水平，结果显示，家蚕幼虫中重组蛋白的表达量比细胞表达量平均高达70倍。此外，利用家蚕为宿主，相比昆虫细胞具有成本低，易形成自主产业等优势。

表2 病毒感染家蚕幼虫不同时间点后 C因子相对活性的比较Table 2 Relative activity of Factor C at different times after infection by virus

图7 重组Factor C的活性检测Fig. 7 Activity detection of recombinant Factor C. (A)Dynamic curve of endotoxin detection. (B)Standard curve of endotoxin detection.

本研究通过RT-PCR获得了东方鲎的factor C基因序列，利用Bac-to-Bac/BmNPV表达系统，首次在家蚕幼虫中表达了重组Factor C，并用动态荧光法检测到了Factor C的活性。由于家蚕血清中的某些丝氨酸蛋白酶也能非特异切割荧光底物，产生荧光信号，对血清进行稀释能降低干扰。研究显示，病毒感染的家蚕血清稀释100、500、1 000倍时均能够检测到重组Factor C的活性。其中，稀释 500倍时检测的信噪比较高，且具有较高灵敏度，表明了重组 Factor C在家蚕幼虫中有较高的表达。Factor C表达载体的N端带有6个组氨酸 (his)，用重组病毒感染BmN细胞和家蚕幼虫，用抗 his-标签的抗体对细胞裂解液和血清做Western blotting分析。前者能检测到 100 kDa的目的带，后者未能检测到his标签，推测重组Factor C在家蚕幼虫中表达时N端的his标签随信号肽一起被切除后，蛋白分泌到血清中。由于环境中内毒素的存在，以及稀释倍数较高，表达的重组Factor C对LPS的灵敏度目前只能到0.2 EU/mL，但仍达到了普通鲎试剂的检测水平(0.5–0.125 EU/mL)。如何有效降低家蚕血清中的干扰，以及获得更高的检测灵敏度，还需要进一步的研究。本研究为开发低成本新型内毒素检测试剂奠定了基础。

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