产甘露聚糖酶细菌的分离鉴定、酶的部分纯化及酶学性质研究

吴华伟+蔚鑫鑫+陈雪秋

摘要：以魔芋粉为惟一碳源作为富集条件，利用刚果红染色法从玉米地土壤中筛选到1株产β-甘露聚糖酶的菌株，经摇瓶培养后其酶活力达到101 U/mL。经形态观察及16S rDNA序列分析，鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和疏水层析对酶进行了部分纯化。对酶的酶学性质研究发现，该酶的最适反应温度为50 ℃，最适反应pH为5.0；在45～55 ℃时酶的稳定性较好，保温30 min后其残留活性在80%以上，在pH4.5～5.5时酶的稳定性较好，保持30 min后其残留活性在80%以上。

关键词：甘露聚糖酶；分离；鉴定；纯化；酶学性质

中图分类号：S154.3；Q939 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）09-3601-05

Isolation， Identification， Partial Purification and Enzymatic Characterization of β-mannanase Producing Strain

WU Hua-wei， WEI Xin-xin， CHEN Xue-qiu

（College of Life Science， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei，China）

Abstract： Using konjac powder as the sole carbon source， a strain producing β-mannanase was isolated from corn field with Congo red dyeing method and identified as Bacillus subtilis with morphological observation and 16S rDNA sequencing. After shaking- flask culture， the enzyme activity of this strain achieved 101 U/mL. By ammonium sulfate fractional precipitation， anion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography， the enzyme was partly purified and studied on its enzymatic properties. The results showed that the optimal reaction temperature and pH of the produced β-mannanase were 50 ℃ and 5.0， respectively. The enzyme had a good stability under temperature from 45 to 55 ℃ and pH from 4.5 to 5.5， with the enzyme activity remained over 80% for 30 min.

Key words： β-mannanase；isolation； identification； purification；enzymatic properties

收稿日期：2014-01-10

基金项目：国家自然科学基金项目（31100076）

作者简介：吴华伟（1977-），男，湖北宜昌人，副教授，博士，主要从事工业酶与微生物生物技术研究，（电话）13986734380（电子信箱）

wuhuawei-2000@163.com。

在自然界中，半纤维素的含量仅低于纤维素的含量，约占植物干重的25%～30%，是重要的可再生资源[1]。如果将半纤维素进行生物转化生成简单的糖类，再转化成饲料、燃料、食品和化学制品等，对缓解全球的能源和食品危机、环境污染及饲料短缺等有极大意义[2]。β-甘露聚糖酶是属于半纤维素水解酶类，是一种广谱诱导型多功能酶，因其能够以内切的方式降解甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖等中的β-1，4糖苷键而广泛应用于食品、医药、饲料、纺织、造纸及石油开采等行业[3-5]。该酶广泛存在于动物、植物和微生物中，但微生物产的β-甘露聚糖酶具有成本低、来源稳定、容易提取、适用的pH和温度范围广等优点，因此是国内外研究的热点[6]。从20世纪70年代末开始对甘露聚糖酶和其产生菌进行研究，到目前为止已经发现了100多种产酶微生物，包括真菌、细菌和放线菌等[4]。不同来源的微生物产生的酶具有不同的性质，大多数的产酶菌是从土壤中筛选[7]，现在也有学者从稻草堆肥[8]、工厂废液[9]、植物内生菌[10]和海洋环境[11]等筛选到产酶菌株。随着对该酶研究的深入，研究重点已经从最初的产酶菌株筛选、发酵条件优化和酶的性质等方面转移到产酶基因的克隆和异源表达等方面[12]。目前，已有多个微生物来源的β-甘露聚糖酶实现了异源表达[1，4，13]。本试验从玉米地、水稻地、棉花地表层土壤中分离产β-甘露糖酶的菌株，对菌株进行了鉴定，然后初步纯化该酶，并对其酶学性质进行分析，以期对该酶的工业化生产及应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

土样采集：在长江大学试验田进行土壤取样，选取玉米地、水稻地、棉花地的表层土壤，采样时用无菌刮铲采集离地面5～25 cm处的土样10～25 g，装入事先准备好的塑料袋内扎好，4 ℃下保存备用。

培养基：①选择性分离培养基：蛋白胨1 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，魔芋粉10 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.0～7.2；②种子培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g， 蒸馏水1 000 mL。③发酵培养基：魔芋粉20 g，酵母膏5 g，NaNO3 5 g，K2HPO4 5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸馏水1 000 mL。④牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨10 g， 牛肉膏3 g， NaCl 5 g， 琼脂20 g， 蒸馏水1 000 mL。⑤LB固体培养基：酵母膏5 g ，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，NaCl 10 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.4。endprint

主要仪器：分光光度计（Unico）、高速冷冻离心机（Thermo IEC）、Delt320型pH计（梅特勒-托利多仪器公司）、AKTA Explorer 100蛋白纯化系统（GE公司）

1.2 方法

1.2.1 β-甘露聚糖酶产生菌的筛选

1）初筛。称取1 g样品，进行10倍梯度稀释，从10-4、10-5、10-6 3个稀释度溶液中各吸取0.5 mL涂布于选择性分离培养基上，37 ℃培养2～3 d。对已长出菌落的平板用1 g/L刚果红染色1 h，然后用1 mol/L NaCl脱色1 h。选择水解圈直径与菌落直径的比值（H/C值）大的菌株在相应培养基上进一步划线分离，直至得到纯的单菌落，将纯化后的单菌落进行编号，并接入到斜面种子培养基，用于后续复筛和鉴定。

2）复筛。将初筛选出的菌株接种于50 mL种子培养基，于37 ℃、180 r/min培养48 h后作为种子液。随后取10 mL种子培养液加入50 mL发酵培养基中，于37 ℃、180 r/min培养72 h。培养结束后收集培养液并离心，上清液即为粗酶液，采用DNS法测定粗酶液中甘露聚糖酶活性。

3）酶活测定。以去除还原糖的魔芋粉[用浓度为85%～90%的乙醇按5∶1（g/mL）的比例浸提魔芋粉5次，每次浸提24 h，适当搅拌，浸提好后65 ℃烘干备用]配制成0.5%的溶液作底物[14]。在0.25 mL的底物中加入0.1 mL适当稀释的酶液，在55 ℃下水浴30 min，加入0.75 mL DNS试剂，在沸水中煮沸5 min，冷却后在波长为550 nm下测其吸光度。以有底物无酶作为空白对照。以D-甘露糖作为标准品制作标准曲线，根据标准曲线计算样品中的还原糖含量。

在上述反应条件下，每分钟释放出相当于1μmol D-甘露糖的还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位（U）。

1.2.2 菌株的鉴定

1）常规生理生化鉴定。通过形态学观察、革兰氏染色对所分离的甘露聚糖酶产生菌进行初步鉴定。

2）分子生物学方法鉴定。菌株基因组DNA的提取参照文献[15]，采用16S rDNA通用引物F1（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、F2（5′-AAGTCG

TAACAAGGTA-3′）扩增目的菌株的16S rDNA序列。PCR反应体系（50 μL）为：模版DNA 1μL，dNTP 4 μL，浓度为20 nmol/L的引物各1 μL，0.25 U/μL的ExTaq酶1 μL，10×buffer 5 μL，无菌双蒸水37 μL，混匀。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸90 s，30个循环； 72 ℃延伸10 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化后与pMD18-T载体进行连接，然后转化进大肠杆菌JM109，并测序。将所测定的序列提交到GenBank基因库中，同时应用NCBI的BLAST进行同源性比对，选取同源性较高的典型菌株的16S rDNA序列作为参比对象，然后采用邻接法，用MEGA 5.1构建供试菌与参比菌之间的系统进化树，确定菌株种属。

1.2.3 酶的纯化

1）粗酶液的制备。5 L发酵培养基以2%的接种量接种后，于37 ℃、160 r/min振荡培养13 h，发酵液经5 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。

2）硫酸铵分级沉淀。取8支1.5 mL EP管各加入1 mL粗酶液，分别加固体硫酸铵至20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的饱和度，边加边振荡以防止局部浓度过高使蛋白质变性。4 ℃静置8 h，10 000 r/min离心10 min，分别收集上清液和沉淀。将沉淀用10 mL pH8.5的20 mmol/L的Tris-HCl缓冲液溶解。测上清液和沉淀的酶活并根据相对活力分布和硫酸铵饱和度绘制出盐析曲线图。

3）DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析。将上述收集的沉淀用pH8.5的20 mmol/L的Tris-HCl缓冲液溶解，然后于2 L Tris-HCl缓冲液（pH 8.5，20 mmol/L）中透析过夜，次日将透析过夜的酶液上样到已经用Tris-HCl缓冲液（pH8.5，20 mmol/L）平衡好的DEAE阴离子交换柱（规格：1.6 cm×20 cm）中。以含0～0.5 mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱（流速1.0 mL/min），共500 mL，见峰收集，每管收集5 mL。酶活性较高的峰以SDS–PAGE凝胶电泳检测其纯度。

4）Phenyl Sepharose 6 FF（HS）疏水柱层析。将阴离子交换层析柱处理后的样品溶液与含4 mol/L硫酸铵的磷酸钾缓冲液（50 mmol/L，pH7.0）等体积混合，然后上样至用含2 mol/L硫酸铵的磷酸钾缓冲液（50 mmol/L，pH7.0）平衡好的疏水层析柱（规格：1.6 cm×20 cm）中。用含2～0 mol/L硫酸铵的磷酸钾缓冲液（50 mmol/L，pH7.0）进行线性梯度洗脱，流速为2.0 mL/min，共450 mL，见峰收集，每管收集3 mL。酶活性较高的峰以SDS–PAGE凝胶电泳检测其纯度。

1.2.4 蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝法测定[16]，以牛血清白蛋白为标准。

1.2.5 酶学性质的研究

1）最适反应温度及热稳定性。在pH 6.5的条件下，将酶液在不同温度（30、35、40、45、50、55、60和65 ℃）下反应10 min，测定其吸光度并计算相对酶活力（以最高的酶活力为100%），以考察酶的最适温度。将酶液分别置于45、50、55、60 ℃水浴中保温30 min，然后与底物混合在最适温度50 ℃下反应10 min，在沸水中灭活5 min，冷却后测定其吸光度并计算其残留相对酶活力（以未保温的酶活力为100%），以考察酶的热稳定性。endprint

2）最适反应pH及pH稳定性。分别取pH4.0、4.5、5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（50 mmol/L）和pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的磷酸缓冲液（50 mmol/L）与0.5%魔芋粉溶液按体积比3∶2均匀混合（共0.25 mL），然后加入0.1 mL适当稀释的酶液在55 ℃反应10 min，沸水中灭活5 min，冷却后测定不同pH下各个样品的吸光度，计算出相对酶活力，以pH为横坐标、 以相对酶活力为纵坐标绘制曲线（酶活力最高者为100%），以找出最适合酶催化的pH区间。分别用0.15 mL pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的0.l mol/L磷酸缓冲液与0.1 mL适当稀释的酶液均匀混合，在55 ℃下保温30 min，再与底物在55 ℃反应10 min，然后在沸水中灭活5 min，冷却后测定其吸光度并计算其残留相对活力（以未保温的酶活力为100%），以考察酶的pH稳定性。

2 结果与分析

2.1 β-甘露聚糖酶产生菌株的分离与筛选结果

2.1.1 分离筛选结果 经分离筛选得到1株较好的产β-甘露聚糖酶的菌株（MAN），该菌株来自玉米地表层土壤。刚果红染色后其H/C值为2.47，如图1所示。将初筛得到的菌株进行摇瓶发酵产酶试验，测其发酵72 h后发酵液中β-甘露聚糖酶活力为101 U/mL。

2.2 菌株的鉴定结果

2.2.1 形态鉴定 菌落形态为圆形，颜色为淡黄色，边缘整齐，且表面粗糙不透明。菌株的菌体呈杆状，中生椭圆形芽孢，革兰氏染色阳性。

2.2.2 菌株的16S rDNA鉴定结果 提取菌株的基因组DNA，通过PCR得到菌株的16S rDNA，如图2所示。由北京澳科鼎盛公司测得16S rDNA部分的序列长度为1 508 bp，GenBank登陆号为：KF032827。用BLAST比对发现菌株的16S rDNA序列和芽孢杆菌属（Bacillus）细菌的相似度较高，用Clustalw软件对该属已经鉴定的菌株进行多重序列比对后，用MEGA4.0软件构建了系统发育树，如图3所示。从图3可以看出，筛选到的产酶菌株（MAN）与芽孢杆菌的序列同源性较高，尤其与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）有着较高的同源性，与Bacillus subtilis W-6 16S（JX462604.1）菌处于同一发育地位。

2.3 甘露聚糖酶的初步分离纯化

根据粗酶液的硫酸铵盐析曲线（未给出），直到硫酸铵浓度达到40%饱和度时目的酶才开始沉淀，于是先向粗酶液中加固体硫酸铵至40%饱和度以除去部分杂蛋白， 4 ℃静置8 h，10 000 r/min离心10 min，收集上清液，再向收集的上清液中加硫酸铵至饱和度为70%，4 ℃静置8 h，10 000 r/min离心10 min，沉淀后用作下一步纯化。

DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱洗脱时有2个明显的洗脱峰，通过对收集管中的酶活力进行检测，选择其中酶活力较高的5管（10～14管）合并（图4）。Phenyl Sepharose 6 FF（HS）疏水柱层析后的收集管，根据酶活力测定和SDS-PAGE的结果，最后选择其中的5管（12～16管）合并（图5），浓缩后用于酶学性质测定。SDS-PAGE显示初步纯化的酶液中有2条带，其中浓度较低的一条可能是杂带，相较于原酶液已经具有很高的纯度，并且目的酶亚基的分子质量大约在29.0～44.0 kDa，和GeneBank中已经报道的枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶的大小一致。

2.4 β-甘露聚糖酶酶学性质的测定结果

2.4.1 温度对β-甘露聚糖酶活性的影响 不同温度下（30～65 ℃）测定的酶活结果如图6所示。由图6可以看出，在pH6.5的条件下，在30～50 ℃之间，酶的活性随着温度的升高而迅速上升，温度为50 ℃时酶的活性最高，当温度高于50 ℃时，酶的活性急剧下降，说明酶已经较快地失活了。因此，确定酶的最适温度为50 ℃。

2.4.2 温度对β-甘露聚糖酶稳定性的影响 由图7可见，在45～55 ℃之间酶的相对稳定性较好，残留活性均在80%以上，且曲线比较平稳，温度超出这一范围后酶活性迅速下降，说明酶已经较快地失活，表明酶宜在50 ℃左右的条件下保存或进行催化反应。

2.4.3 pH对β-甘露聚糖酶活性的影响 从图8可以看出，在pH4.0～7.5范围内酶活性呈现出先上升后下降的趋势。在温度为55 ℃的条件下，在pH4.0～5.0之间，酶活性随着pH的提高而迅速上升，pH为5.0时，酶的活性最高，但当pH超出这一范围后，酶的活性急剧下降，说明酶已经较快地失活。表明酶于55 ℃时的最适pH为5.0。

2.4.4 pH对β-甘露聚糖酶稳定性的影响 由图9可见，在pH4.5～5.5之间酶的相对稳定性较好，其残留活性均在80%以上，pH超过5.5后酶活性下降较快，酶活性的大小受pH影响较大，pH过大或过小都会使酶蛋白变性，从而导致其酶活性下降甚至失活。因此宜选择pH4.5～5.5的条件下保存酶或进行酶促反应。

3 结论

本试验从玉米地表层土壤中分离出一株β-甘露聚糖酶产生菌（MAN），摇瓶培养后酶活力达到101 U/mL。通过16S rDNA保守序列的鉴定，发现其与枯草芽孢杆菌同源关系很近，应该属其下的一个种类或亚种。利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析对酶进行了部分纯化。酶学性质研究表明，该酶的最适反应温度为50 ℃，最适反应pH为5.0；在45～55 ℃之间酶的稳定性较好，保温30 min后其残留活性均在80%以上；在pH4.5～5.5之间酶的稳定性较好，保持30 min后其残留活性均在80%以上。

参考文献：endprint

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