二十二碳六烯酸对白介素1β诱导的动脉平滑肌细胞增殖和迁移的影响及机制探究

拓步雄等

[摘要] 目的 探讨二十二碳六烯酸（DHA）对白介素1β（IL-1β）诱导的动脉平滑肌细胞增殖和迁移的影响及机制。 方法 血管平滑肌细胞（VSMCs）培养及传代后，分为对照组、IL-1β组、DHA组、IL-1β和DHA处理组四组，其中对照组细胞加入50 μL磷酸盐缓冲液（PBS）；IL-1β组细胞加入10 ng/mL IL-1β；DHA组细胞加入80 μmol/L DHA；IL-1β和DHA处理组加入10 ng/mL IL-1β和80 μmol/L DHA，培养48 h后，噻唑蓝（MTT）法和Transwell法检测VSMCs的增殖和迁移情况；qRT-PCR和Western blotting技术检测基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）-1、TIMP-2和Notch3的表达情况。 结果 VSMCs的增殖率和迁移能力经IL-1β处理后显著增高，而IL-1β和DHA处理组显著低于IL-1β处理组（F=25.537，P=0.003）；MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的表达量经IL-1β处理后显著增高，而经IL-1β和DHA共处理后显著低于IL-1β组（MMP-2：F=34.286，P=0.000；TIMP-2：F=21.034，P=0.009；MMP-9：F=31.732，P=0.000；TIMP-1：F=18.213，P=0.021）；IL-1β组细胞Notch3表达量显著降低，IL-1β和DHA处理组中Notch3的表达水平则显著高于IL-1β处理组（F=39.235，P=0.000）。 结论 DHA可通过Notch信号通路抑制VSMCs的增殖和迁移。

[关键词] 二十二碳六烯酸；白介素1β；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-9；组织金属蛋白酶抑制剂-1；组织金属蛋白酶抑制剂-2；Notch3

[中图分类号] R544.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）09（c）-0021-05

Effect and mechanism study of Docosahexaenoic Acid for vascular smooth muscle cells proliferation and migration induced by IL-1β

TUO Buxiong LI Chaomin YE Mingxia LIU Wei LI Hui▲

Department of Cardiology， the 451st Hospital of PLA， Shaanxi Province， Xi′an 710054， China

[Abstract] Objective To study the effect and mechanism study of Docosahexaenoic Acid （DHA） for vascular smooth muscle cells （VSMC） proliferation and migration induced by interleukin （IL-1β）. Methods Subcultured VSMCs were divided into four groups： control group， DHA group， IL-1β group and IL-1β combined with DHA group. Cells were cocultured with 50 μL PBS in control group， with 10 ng/mL IL-1β in IL-1β group， with 80 μmol/L DHA in DHA group， with 10 ng/mL IL-1β and 80 μmol/L DHA in IL-1β combined with DHA group for 48 h. MTT and Transwell methods were used to detect VSMCs proliferation and migration. qRT-PCR and Western blotting methods were used to measure the expression of matrix metalloproteinase （MMP）-2， MMP-9， tissue inhibitor of metalloproteinase （TIMP）-1， TIMP-2 and Notch3. Results The proliferation and migration of VSMCs significantly increased in IL-1β group ， while the proliferation and migration ability of VSMCs significantly decreased compared with IL-1β group （F=25.537， P=0.003）. In IL-1β group， the expression of MMP-2， MMP-9， TIMP-1 and TIMP-2 significantly increased （P < 0.05）， whereas the expression of MMP-2， MMP-9， TIMP-1 and TIMP-2 in IL-1β combined with DHA group significantly decreased compared with IL-1β group （MMP-2： F=34.286， P=0.000； TIMP-2： F=21.034， P=0.009； MMP-9： F=31.732， P=0.000； TIMP-1： F=18.213， P=0.021）. The expression of Notch3 in IL-1β group was significantly lower， while in the IL-1β combined with DHA group the expression of Notch3 was significantly higher than that in the IL-1β group （F=39.235， P=0.000）. Conclusion DHA can inhibit VSMCs proliferation and migration through the Notch signaling pathway.

[Key words] Docosahexaenoic Acid； IL-1β； MMP-2； MMP-9； TIMP-1； TIMP-2； Notch3

血管壁结构的改变是高血压病理改变的普遍特征。目前普遍认为，高血压基本病理改变是血管重塑。动脉壁中膜肥厚是高血压血管壁增厚的主要原因，这与血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖和迁移密切相关。研究表明多不饱和脂肪酸如二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid，DHA）可降低心血管疾病的发病率和病死率[1]。DHA除了具有很好的降血脂作用外，还可以通过影响内皮细胞和VSMCs的生物学行为进而调节血压。在炎性反应中DHA可降低VSMCs的增殖和迁移[2-3]。研究表明，在高血压、血管再狭窄和动脉粥样硬化过程中VSMCs的增殖和迁移与基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）降解细胞外基质密切相关[4]。当血管损伤后炎症因子高表达，上调MMP-2和MMP-9，使细胞外基质大量降解，加速了VSMCs向血管内膜迁移，导致血管壁增厚，引起血压上升，血栓形成[5-6]。目前，有关DHA的降血压机制的研究尚不多见。本文通过研究DHA对VSMCs增殖及迁移的影响，以及对基质金属蛋白酶及其抑制剂含量的变化探讨了DHA对高血压的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雄性SD大鼠，山东绿叶制药有限公司动物实验中心提供，合格证号：20030020；干粉培养基（DMEM），美国Gibco公司生产；Trizol，加拿大Invitrogen公司提供；Quantscript RT kit，总RNA提取试剂盒购自于Takara公司；琼脂糖购自于BioWest公司；RIPA裂解液，购自于美国Millipore公司；DHA、噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）和胰蛋白酶购自于Sigma公司；水套式二氧化碳孵箱，美国Nuaire公司生产；超净工作台，苏州净化设备公司生产；PCR仪：MJ Research INC生产。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 8周龄的雄性大鼠，颈椎脱臼处死，取胸主动脉，放入磷酸盐缓冲液（PBS）中清洗。剥去动脉外膜及内膜，取血管的中层组织洗净后剪成1 mm2大小的组织块，按组织贴块法接种于200 mL/L胎牛血清的DMEM培养液中，于5%CO2、37℃下培养24 h。待细胞达到80%的融合后，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 实验分组处理 消化细胞并收集细胞悬液，将细胞以1×105/孔接种于24孔细胞培养板中，然后将细胞随机分为四组：对照组细胞加入50 μL PBS培养48 h；IL-1β组细胞加入10 ng/mL IL-1β共培养48 h；DHA组细胞加入80 μmol/L DHA培养48 h；IL-1β和DHA处理组细胞加入10 ng/mL IL-1β和80 μmol/L DHA培养48 h。

1.2.3 MTT检测细胞增殖 细胞增殖采用MTT法进行检测。细胞消化后通过计数板计数，将细胞以1×104/孔的密度接种至96孔培养板中。接种12 h后，按上述分组方法进行培养。每组做6个重复。培养48 h后每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，37℃恒温箱中培养4 h，去上清，每孔加入200 μL DMSO，振摇20 min，用紫外分光光度计测定570 nm下的光密度值（OD）。

1.2.4 Transwell法检测细胞侵袭 在24孔Transwell上室聚碳酸酯膜（膜孔径8 μm）上涂1 g/L的matrigel 70 μL，37℃，60 min使之在微孔滤膜上重组为基底膜结构。取对数生长期的VSMCs，以DMEM培养液[不加胎牛血清（FBS）]，调整细胞悬液中细胞数为l×105/mL，取200 μL细胞悬液接种于Transwell上室内，下室加入10%FBS的DMEM培养液500 μL，37℃，5%CO2培养24 h后，将滤膜上层细胞用棉签抹去，滤膜以甲醇固定，然后用结晶紫染色15 min。100倍光镜下选择膜上、下、左、右、中5个不同视野的穿过膜细胞数，求平均值。

1.2.5 qRT-PCR检测 VSMCs细胞分组处理48 h后，利用PBS清洗细胞3遍，然后胰酶消化收集细胞，依据试剂盒说明，采用Trizol（Invitrogen，CA）抽提法提取总RNA，提取出的RNA用紫外分光光度计测OD值，以确定RNA的浓度和纯度；采用Quantscript RT kit反转录合成cDNA，PCR扩增。PCR扩增条件：94℃，1.5 min；94℃，1 min；64℃，1 min；72℃，1 min 40个循环，最后在72℃下延伸10 min，同样的方法扩增内参基因三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）。引物信息见表1。

1.2.6 Western blotting检测蛋白表达 细胞分组处理48 h后，利用PBS清洗细胞3遍，然后胰酶消化收集细胞，用RIPA细胞蛋白裂解液提取细胞中的蛋白，二辛可酸（BCA）法测定蛋白浓度。蛋白样品经SDS-PAGE电泳，上样量为40 μg/行，电泳完毕后，电转移至PVDF膜进行如下处理：牛血清白蛋白（BSA）封闭过夜，一抗（1∶1000比例稀释）室温抚育2 h，磷酸盐吐温缓冲液（PBST）洗涤3次，辣根过氧化物酶（HRP）-IgG（1∶100比例稀释）室温抚育2 h，PBST洗涤3次，电化学发光（ECL）显色，暗室曝光。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，两两比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VSMCs的增殖情况

MTT法检测VSMCs的增殖情况，结果显示，DHA组VSMCs的相对增殖率与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；而IL-1β组VSMCs的相对增殖率显著增高（P < 0.05）；IL-1β和DHA共处理组VSMCs的相对增殖率与IL-1β组VSMCs的相对增殖率相比显著下降（P < 0.01）。见图1。

与对照组比较，*P < 0.05；与IL-1β组比较，t=25.537，#P=0.003；IL-1β：白介素-1β；DHA：二十二碳六烯酸

图1 不同处理组血管平滑肌细胞的相对增殖率

2.2 VSMCs的迁移情况

Transwell法检测VSMCs的迁移，结果显示，DHA组VSMCs的穿膜均数为（18.24±5.31）个，与对照组[（22.17±4.58）个]比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；IL-1β组VSMCs的穿膜均数高达（64.72±21.35）个，显著高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；当经IL-1β处理的VSMCs与DHA共培养时，VSMCs的穿膜数量为（38.94±8.45）个，显著低于IL-1β组VSMCs的穿膜数量，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.3 VSMCs中MMP-2、TIMP-2、MMP-9和TIMP-1的表达

Western blotting检测MMP-2、TIMP-2、MMP-9及TIMP-1在VSMCs中的表达，结果显示，与对照组比较，DHA组VSMCs中MMP-2、TIMP-2、MMP-9、TIMP-1的表达量和MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值改变不显著，差异无统计学意义（P > 0.05）；而IL-1β组的VSMCs中MMP-2、TIMP-2、MMP-9、TIMP-1的表达量和MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值显著增高，差异有统计学意义（P < 0.05）。当经IL-1β处理的VSMCs与DHA共培养48 h后，细胞中的MMP-2、MMP-9的表达量和MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值与IL-1β组相比有显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2、3。

与对照组比较，*P < 0.05；与IL-1β组比较，#P < 0.01；IL-1β：白介素-1β；DHA：二十二碳六烯酸；MMP：基质金属蛋白酶；TIMP：组织金属蛋白酶抑制剂；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

图2 不同处理组血管平滑肌细胞中MMP-2和TIMP-2的表达

与对照组比较，*P < 0.05；与IL-1β组比较，#P < 0.01；IL-1β：白介素-1β；DHA：二十二碳六烯酸；MMP：基质金属蛋白酶；TIMP：组织金属蛋白酶抑制剂；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

图3 不同处理组血管平滑肌细胞中MMP-9和TIMP-1的表达

2.4 Notch信号通路关键调控因子Notch3在VSMCs中的表达

DHA组VSMCs中Notch3的表达量与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；Notch3在IL-1β组VSMCs中的表达量显著低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；当经IL-1β处理的VSMCs与DHA共培养48 h后，VSMCs中的Notch3表达量与IL-1β组相比显著增高，差异有统计学意义（P < 0.05），提示DHA对VSMCs增殖和迁移的抑制作用是通过Notch信号通路实现的。见图4。

3 讨论

VSMCs是构成血管壁的重要组成成分，其增殖过度是导致多种心血管疾病，尤其是高血压、动脉粥样硬化、血管再狭窄等的关键环节[7-8]。正常成熟的血管中VSMCs处于分化状态，当局部血管在炎症因子等刺激作用下损伤后，局部释放大量细胞因子和生长因子，使位于中膜的VSMCs表型发生改变，导致细胞收缩功能消失，并由中膜向内膜迁移、增殖，同时分泌大量的细胞外基质（extra-cellular matrix，ECM）。本实验用炎症因子IL-1β对VSMCs进行了处理，诱导VSMCs细胞发生炎性反应，引起其大量增殖，然后用DHA进行处理，比较不同处理组VSMCs中MMP-2和MMP-9及其抑制剂的表达差异，并对Notch信号途径中的主要调控因子Notch3进行了检测，探讨DHA对VSMCs增殖和迁移的影响及机制。

MMPs是一类可降解ECM的锌蛋白酶家族，以酶原的形式分泌，由其他蛋白酶或炎症因子激活，在组织重构及ECM的动态平衡中发挥着重要作用[9]。TIMPs是MMPs的主要抑制剂，主要由肌成纤维细胞、VSMCs、激活的星形胶质细胞等分泌，其分泌为基本的生理所需，随MMPs的表达而表达，二者维持在一定的比例，调节ECM的动态平衡，若二者的比例失衡，将引起多种病理反应。本研究发现经IL-1β诱导的VSMCs的增殖及迁移能力显著增高，且MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的表达量显著上调，MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值均显著增高，比例失调。与DHA共培养后VSMCs的增殖及迁移能力显著下降，MMP-2和MMP-9的表达量及MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值都表现为显著下调。说明VSMCs的增殖及迁移与MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比例失衡具有相关性，DHA可以降低MMP-2和MMP-9的表达量，从而降低MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值，对抑制VSMCs的增殖及迁移发挥重要的作用。

Notch信号通路一条最初发现于果蝇、高度保守的信号转导途径，广泛存在于各种生物体内。Armulik等[10]的研究发现Notch信号通路在调节VSMCs形态和功能中发挥重要作用。本研究发现：经IL-1β处理的VSMCs中低表达Notch3；经IL-1β处理的VSMCs与DHA共培养后Notch3的表达量表现为显著增高，VSMCs的增殖和迁移能力也显著降低，说明Notch3在DHA抑制平滑肌细胞增殖和迁移中发挥重要作用。

DHA对VSMCs生理功能的调节作用已被多个研究所报道[11-12]。有研究认为ω-3不饱和脂肪酸特别是DHA一方面极易与膜磷脂或三酰甘油相融合并增加VSMCs膜固醇类的流动从而对与胞膜密切相关的信号分子产生影响[13]，而另一方面对细胞膜离子通道进行调控，最终调节细胞内的信号转导[14]。

综上所述，本研究发现DHA可以降低炎性反应所引起的VSMCs中MMP-2和MMP-9的高表达，调节MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比例，抑制VSMCs的增殖和迁移，在高血压的病理过程中发挥重要作用。同时，本研究发现DHA发挥调节作用的过程中Notch3起到了关键性的作用，此结果提示DHA作用的发挥可能是通过Notch信号通路实现的。

[参考文献]

[1] NO authors. Dietary supplementation with n-3 polyunsaturated fatty acids and vitamin E after myocardial infarction： results of the GISSI-Prevenzione trial. Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell'infarto miocardico [J]. Lancet，1999，354（9177）：447-455.

[2] Abeywardena MY，Head RJ. Longchain n-3 polyunsaturated fatty acids and blood vessel function [J]. Cardiovasc Res，2001，52（3）：361-371.

[3] Robinson JG，Stone NJ. Antiatherosclerotic and antithrombotic effects of omega-3 fatty acids [J]. Am J Cardiol，2006，98（4A）：39-49.

[4] Galis ZS，Khatri JJ. Matrix metalloproteinases in vascular remodeling and atherogenesis： the good， the bad， and the ugly [J]. Circ Res，2002，90（3）：251-262.

[5] Bond M，Chase AJ，Baker AH，et al. Inhibition of transcription factor NF-kappaB reduces matrix metalloproteinase-1，-3 and -9 production by vascular smooth muscle cells [J]. Cardiovasc Res，2001，50（3）：556-565.

[6] Wang M，Zhao D，Spinetti G，et al. Matrix metalloproteinase 2 activation of transforming growth factor-beta1 （TGF-beta1） and TGF-beta1-type Ⅱ receptor signaling within the aged arterial wall [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006， 26（7）：1503-1509.

[7] Hattori Y，Hattori S，Sato N，et al. High-glucose-induced nuclear factor κB activation in vascular smooth muscle cells [J]. Cardiovase Res，2000，46（1）：188-197.

[8] 赵娟，王红，于伞鑫，等.Urantide对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响[J].吉林大学学报：医学版，2011，37（6）：1079-1082.

[9] Oheake Y，Tojo H，Seiki M. Multifunctional roles of MTl-MMP in myofiber formation and morphostatic maintenance of skeletal muscle [J]. J Cell Sic，2006，119（18）：3822-3832.

[10] Armulik A，Abramsson A，Betsholtz C. Endothelial/pericyteinteractions [J]. Circ Res，2005，97（6）：512-523.

[11] Botham KM，Wheeler-Jones CP. Postprandial lipoproteins and the molecular regulation of vascular homeostasis[J]. Prog Lipid Res，2013，52（4）：446-464.

[12] Song J，Kwon N，Lee MH，et al. Association of serum phospholipid PUFAs with cardiometabolic risk： beneficial effect of DHA on the suppression of vascular proliferation/inflammation [J]. Clin Biochem，2014，47（6）：361-368.

[13] Dusserre E，Pulcini T，Bourdillon MC，et al. ω-3 Fatty acids in smooth muscle cell phospholipids increase membrane cholesterol efflux [J]. Lipids，1995，30（1）：35-41.

[14] Hirafuji M，Machida T，Hamaue N，et al. Cardiovascular protective effects of n-3 polyunsaturated fatty acids with special emphasis on docosahexaenoic acid [J]. J Pharmacol Sci，2003，92（4）：308-316.

（收稿日期：2014-05-25 本文编辑：卫 轲）

DHA对VSMCs生理功能的调节作用已被多个研究所报道[11-12]。有研究认为ω-3不饱和脂肪酸特别是DHA一方面极易与膜磷脂或三酰甘油相融合并增加VSMCs膜固醇类的流动从而对与胞膜密切相关的信号分子产生影响[13]，而另一方面对细胞膜离子通道进行调控，最终调节细胞内的信号转导[14]。

综上所述，本研究发现DHA可以降低炎性反应所引起的VSMCs中MMP-2和MMP-9的高表达，调节MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比例，抑制VSMCs的增殖和迁移，在高血压的病理过程中发挥重要作用。同时，本研究发现DHA发挥调节作用的过程中Notch3起到了关键性的作用，此结果提示DHA作用的发挥可能是通过Notch信号通路实现的。

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[12] Song J，Kwon N，Lee MH，et al. Association of serum phospholipid PUFAs with cardiometabolic risk： beneficial effect of DHA on the suppression of vascular proliferation/inflammation [J]. Clin Biochem，2014，47（6）：361-368.

[13] Dusserre E，Pulcini T，Bourdillon MC，et al. ω-3 Fatty acids in smooth muscle cell phospholipids increase membrane cholesterol efflux [J]. Lipids，1995，30（1）：35-41.

[14] Hirafuji M，Machida T，Hamaue N，et al. Cardiovascular protective effects of n-3 polyunsaturated fatty acids with special emphasis on docosahexaenoic acid [J]. J Pharmacol Sci，2003，92（4）：308-316.

（收稿日期：2014-05-25 本文编辑：卫 轲）

DHA对VSMCs生理功能的调节作用已被多个研究所报道[11-12]。有研究认为ω-3不饱和脂肪酸特别是DHA一方面极易与膜磷脂或三酰甘油相融合并增加VSMCs膜固醇类的流动从而对与胞膜密切相关的信号分子产生影响[13]，而另一方面对细胞膜离子通道进行调控，最终调节细胞内的信号转导[14]。

综上所述，本研究发现DHA可以降低炎性反应所引起的VSMCs中MMP-2和MMP-9的高表达，调节MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比例，抑制VSMCs的增殖和迁移，在高血压的病理过程中发挥重要作用。同时，本研究发现DHA发挥调节作用的过程中Notch3起到了关键性的作用，此结果提示DHA作用的发挥可能是通过Notch信号通路实现的。

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[6] Wang M，Zhao D，Spinetti G，et al. Matrix metalloproteinase 2 activation of transforming growth factor-beta1 （TGF-beta1） and TGF-beta1-type Ⅱ receptor signaling within the aged arterial wall [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006， 26（7）：1503-1509.

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[10] Armulik A，Abramsson A，Betsholtz C. Endothelial/pericyteinteractions [J]. Circ Res，2005，97（6）：512-523.

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[13] Dusserre E，Pulcini T，Bourdillon MC，et al. ω-3 Fatty acids in smooth muscle cell phospholipids increase membrane cholesterol efflux [J]. Lipids，1995，30（1）：35-41.

[14] Hirafuji M，Machida T，Hamaue N，et al. Cardiovascular protective effects of n-3 polyunsaturated fatty acids with special emphasis on docosahexaenoic acid [J]. J Pharmacol Sci，2003，92（4）：308-316.

（收稿日期：2014-05-25 本文编辑：卫 轲）