高效液相色谱-串联质谱法测定香菇中23种有机磷农药

梁达清，苏肯明，张菊梅，郭伟鹏

（广东省微生物研究所，省部共建华南应用微生物国家重点实验室（省部共建国家重点实验室培育基地），广东省微生物应用新技术公共实验室，广东省微生物分析检测中心，广东 广州 510070）

高效液相色谱-串联质谱法测定香菇中23种有机磷农药

梁达清，苏肯明，张菊梅，郭伟鹏

（广东省微生物研究所，省部共建华南应用微生物国家重点实验室（省部共建国家重点实验室培育基地），广东省微生物应用新技术公共实验室，广东省微生物分析检测中心，广东 广州 510070）

采用高效液相色谱-串联质谱法测定香菇中23种有机磷农药残留。样品通过乙腈提取、盐析分配，得到的乙腈提取液采用C18和N-丙基乙二胺粉末分散固相萃取净化，经高效液相色谱-串联质谱仪分析，采用电喷雾正离子方式及多反应监测模式测定，基质匹配标准溶液外标法定量。方法的定量限达到0.01mg/kg；回收率为70.2%～105.0%，相对标准偏差为3.5%～13.0%。该方法灵敏、准确、快速，可满足香菇中多种有机磷农药残留的检测要求。

高效液相色谱-串联质谱法；有机磷农药；残留；香菇

香菇含有大量多糖、嘌呤、核酸及含硫香味成分等，味道鲜美，营养丰富，且具有降低血压、抗病毒、抗癌等功效[1-2]，是一种重要的食用菌。在栽培过程中，若使用有农药污染的基质载体或因病虫害严重而大量使用农药，容易造成农药残留超标。有机磷农药是一种高效、广谱的杀虫剂，多数属剧毒和高毒类，对人体有极大的危害。各国都加强了对农药残留的监控，美国、欧盟、日本等均制定了日益严格的限量标准，如日本《食品中残留农业化学品肯定列表制度》中对多数有机磷农药的限量为0.01mg/kg[3]。因此简便快速的农药多残留检测技术是今后农残检测的发展方向和研究热点。

目前有机磷农药残留的测定方法主要有气相色谱法[4-13]、气相色谱-质谱法[14-20]、高效液相色谱-串联质谱法[21-25]，而用高效液相色谱-串联质谱法测定香菇中多种有机磷农药残留的方法未见报道。用气相色谱测定有机磷农药时，衬管中的玻璃纤维对乙酰甲胺磷和氧化乐果吸附严重，易导致测试灵敏度降低，当除掉衬管中的玻璃纤维时，灵敏度提高，但样品中的高沸点杂质污染分流平板及毛细管色谱柱，给气相色谱仪的清洁和维护带来不便；香菇中的含硫成分对气相色谱法测定有机磷产生严重的干扰。高效液相色谱-串联质谱法由于无需加热，在分析易分解农药时有一定优势，多反应监测模式也可以消除一些干扰，且质谱定性是一种比较可靠的手段。因此本研究采用分散固相萃取净化、高效液相色谱-串联质谱法测定香菇中23种有机磷农药，优化了样品前处理和质谱测定参数，建立了香菇中多种有机磷的测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜香菇和干香菇 市购；23种有机磷标准品 农业部环境保护科研监测所；C18和N-丙基乙二胺（primarysecondary amine，PSA）粉末 美国Agilent公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯） 美国Tedia公司；氯化钠、无水硫酸镁（均为分析纯） 广州化学试剂厂；实验用水为三重过滤去离子水。

1.2 仪器与设备

1290-6430A 高效液相色谱-串联质谱仪（配有电喷雾离子源） 美国Agilent公司；KQ3200DE型数控超声波清洗器 河南兄弟仪器设备有限公司；IKA高速分散均质机 德国IKA公司；KDC-40低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；MTN-2800D氮吹仪 北京博远科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品提取

鲜香菇：称取10.00g粉碎好的样品置于50mL离心管中，加入20mL乙腈，于10000r/min均质1min，加入3g氯化钠，充分振荡，于3500r/min离心5min，吸取乙腈层10mL于玻璃管中，待净化。

干香菇：称取5.00g粉碎好的样品置于50mL离心管中，加入10mL水，再加入20mL乙腈，充分振荡，于超声波提取仪提取30min，加入3g氯化钠，充分振荡，于3500r/min离心5min，吸取乙腈层10mL于玻璃管中，待净化。

1.3.2 样品净化

在提取液中加入0.2g C18粉末、0.3g PSA粉末、2g无水硫酸镁，振荡2min，于3500r/min离心5min，移取一定体积上清液（鲜香菇4 mL、干香菇8 mL）在40 ℃用氮气吹至近干，以甲醇-水（1∶1，V/V）定容至1 mL，过0.22 μm滤膜，待测定。

1.3.3 标准溶液的配制

取空白香菇样品按1.3.1节提取和1.3.2节净化吹干后，用标准溶液代替纯溶剂定容至1 mL，得到基质匹配标准溶液。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：VenusilMP C18色谱柱（100mm×2.1mm，3 μm）；流动相A为0.2%甲酸（V/V，下同）溶液，流动相B为甲醇；流速0.2 mL/min；梯度洗脱程序：0～4min，10%～50%B；4～10min，50%～60%B；10～15min，60%～70%B；15～18min，70%～95%B；18～22min，95%～100%B；22～25min，100%B；25～25.1min，100%～10%B；25.1～30min，10%B；柱温30 ℃；进样量10μL。

1.3.5 质谱条件

电喷雾离子源；多反应监测模式；干燥气温度350 ℃；干燥气流量10L/min；毛细管电压4000V；源温度100 ℃。

2 结果与分析

2.1 提取条件的选择

表 1 提溶剂对鲜香菇、干香菇中23种有机磷提取率的影响（加标0.022 mg//kkgg））TTaabbllee 1 1 EEffecctt o of fe xetxratcraticotni osonl vseonltvse onnt tsh oe nre tchoeve rreyc oof v2e3ry of 23 rgaannoopphohsopshpohruosr puess tpiceisdteisc firdoems freosmh a fnrde sdhri eadn d dried Lentinus edooddeess spiikkeedd a ta 0t.02.0 m2 gm/kgg/kg % o序号 名称 鲜香菇 干香菇乙腈 丙酮 甲醇 乙腈 丙酮 甲醇1 甲胺磷 72.7 62.5 65.7 71.3 61.3 59.8 2 乙酰甲胺磷 73.4 63.2 66.4 78.4 68.5 61.3 3 氧化乐果 78.5 58.4 60.2 76.6 66.8 62.4 4 久效磷 80.4 70.1 73.7 78.2 68.1 71.5 5 乐果 82.5 73.5 75.0 92.5 72.3 80.1 6 敌敌畏 77.4 67.8 69.1 79.1 60.4 68.7 7 杀扑磷 83.5 73.4 76.5 76.7 64.7 71.4 8 亚胺硫磷 81.4 61.5 77.3 89.5 65.5 60.9 9 甲基对硫磷 79.9 71.1 70.2 75.7 71.2 73.0 10 马拉硫磷 89.2 69.3 68.3 82.6 62.5 74.6 11 氯唑磷 87.8 80.2 79.4 88.7 78.4 80.2 12 水胺硫磷 76.5 71.6 68.5 79.3 72.6 72.8 13 三唑磷 94.3 82.3 86.4 92.1 77.6 72.9 14 灭线磷 75.7 72.6 70.7 81.4 71.5 77.5 15 杀螟硫磷 85.0 80.1 68.3 87.5 70.9 72.4 16 对硫磷 73.8 71.7 62.6 78.1 72.7 63.8 17 伏杀硫磷 77.5 72.9 57.4 75.8 69.8 69.3 18 甲拌磷 78.7 68.4 60.7 74.6 64.5 60.7 19 甲基毒死蜱 80.1 79.6 55.8 88.7 67.9 52.9 20 丙溴磷 102 92.1 67.3 94.6 75.8 60.3 21 乙硫磷 78.3 72.5 56.1 77.3 67.2 64.1 22 毒死蜱 88.3 78.7 61.5 84.9 69.8 77.5 23 乙拌磷 75.3 70.6 57.8 73.6 64.5 68.2

有机磷的极性不同，在不同的提取剂中的溶解度也不同。为了提取有机磷，分别用丙酮、甲醇、乙腈作为提取溶剂进行研究，提取率见表1，发现乙腈的提取率最高，杂质相对较少，选择乙腈为提取剂。由于PSA粉末对样品中的强极性杂质，如有机酸、糖类，有良好的净化效果，而C18去除油脂等非极性杂质效果显著，无水硫酸镁可除去少量水分。因此针对香菇中的干扰成分，采用C18、PSA粉末和无水硫酸镁进行净化。

2.2 质谱参数的优化

配制1mg/L各有机磷单一标准溶液进行质谱条件优化：在电喷雾正离子模式下，利用自动优化软件设定各有机磷的相对分子质量、碎裂电压范围、碰撞能量范围、子离子范围，根据最大离子丰度最终确定定量离子、定性离子、碎裂电压及碰撞能量。其中乙拌磷用自动优化软件无法得到正确的子离子，需通过手动设定母离子，在正离子模式下扫描子离子，确定了子离子后再优化碎裂电压和碰撞能量。优化后的结果见表2。

注：⋆.定量离子。

2.3 方法的定量限、回收率、精密度和线性范围

采用阴性样品进行加标回收实验，在0.01mg/kg加标水平的信噪比均大于10，确定该方法的定量限为0.01mg/kg。用空白基质配制标准曲线测试，线性范围、相关系数和线性方程见表3。在样品中分别添加0.01、0.02、0.05mg/kg的各有机磷标准品，进行加标回收实验，3水平的回收率、相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）见表4。回收率为70.2%～105.0% ，RSD为3.5%～13.0%，满足农残分析的要求。香菇中的含硫组分在前处理中难以完全除去，由于其极性小，在电喷雾离子源质谱仪中的响应值低，在反相色谱仪中的保留时间长，对极性和中等极性的有机磷无干扰；乙拌磷由于极性小，受干扰大，导致回收率偏低；敌敌畏由于容易挥发，在前处理中损失严重，导致回收率不高。

表 3 方法的线性范围、标准曲线方程、相关系数及定量限Table 3 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients and Table 3 Linear ranges, linear equations, correlation coefficien ts and limits of quantification of 23 organophosphorus pesticides limits of quantification f 23 organophosphoru pesticides序号 名称 线性范围/（μg/L） 线性方程 相关系数定量限/（mg/kg）1 甲胺磷 5.0～100.0 Y=139.3X＋96.87 0.9964 0.0058 2 乙酰甲胺磷 5.0～100.0 Y=189.6X＋126.5 0.9932 0.0031 3 氧化乐果 20.0～200.0 Y=19.33X＋86.94 0.9962 0.0095 4 久效磷 5.0～100.0 Y=122.5X＋446.1 0.9981 0.0056 5 乐果 5.0～100.0 Y=138.3X＋705.1 0.9993 0.0037 6 敌敌畏 5.0～100.0 Y=71.12X－104.1 0.9988 0.0071 7 杀扑磷 20.0～200.0 Y=2.380X＋1.841 0.9957 0.0100 8 亚胺硫磷 20.0～200.0 Y=12.57X＋52.85 0.9987 0.0089 9 甲基对硫磷 20.0～200.0 Y=2.110X＋1.543 0.9952 0.0100 10 马拉硫磷 5.00～100.0 Y=153.7X－305.7 0.9939 0.0042 11 氯唑磷 20.0～200.0 Y=26.72X＋33.71 0.9994 0.0086 12 水胺硫磷 20.0～200.0 Y=2.294X＋3.697 0.9938 0.0100 13 三唑磷 20.0～200.0 Y=28.39X＋75.65 0.9991 0.0082 14 灭线磷 20.0～200.0 Y=70.98X－30.91 0.9967 0.0051 15 杀螟硫磷 20.0～200.0 Y=3.890X＋5.254 0.9984 0.0100 16 对硫磷 20.0～200.0 Y=12.4X－3.56 0.9973 0.0086 17 伏杀硫磷 20.0～200.0 Y=20.98X＋30.2 0.9991 0.0078 18 甲拌磷 20.0～200.0 Y=21.75X－1.83 0.9946 0.0073 19 甲基毒死蜱 20.0～200.0 Y=10.51X－14.32 0.9938 0.0086 20 丙溴磷 20.0～200.0 Y=7.372X＋12.15 0.9995 0.0094 21 乙硫磷 20.0～200.0 Y=56.9X＋569.1 0.9995 0.0068 22 毒死蜱 20.0～200.0 Y=44.23X＋264.8 0.9996 0.0052 23 乙拌磷 20.0～200.0 Y=2.219X＋5.568 0.9956 0.0100

表 4 鲜香菇、干香菇中23种有机磷加标回收率和精密度（n==66）Table 4 Recoveries and RSDs of 23 organophosphorus pesticides in Table 4 Recoveries and RSDs of 23 organophoshorus pesticides i n spiked samples of fresh and dried Lentinus edodes ( siked samples of fresh and dried Lentinus edode ( n == 66)) %序号 名称鲜香菇 干香菇0.01mg/kg 0.02mg/kg 0.05mg/kg 0.01mg/kg 0.02mg/kg 0.05mg/kg回收率 RSD 回收率 RSD 回收率 RSD 回收率 RSD 回收率 RSD 回收率RSD 1 甲胺磷 70.8 8.5 72.7 6.3 75.8 5.9 70.2 8.1 71.3 6.8 70.3 7.2 2 乙酰甲胺磷 77.9 11.0 73.4 9.0 76.9 8.6 75.3 12.0 78.4 8.3 80.4 6.5 3 氧化乐果 70.6 7.3 78.5 6.6 80.6 6.9 74.9 13.0 76.6 11.0 82.2 9.8 4 久效磷 79.8 5.4 80.4 5.8 83.4 5.1 75.0 9.0 78.2 7.0 83.5 6.7 5 乐果 88.6 6.7 82.5 6.2 85.0 5.5 90.1 7.2 92.5 6.3 90.4 6.5 6 敌敌畏 76.3 12.0 77.4 11.0 79.5 10.0 75.8 11.0 79.1 8.3 78.6 8.5 7 杀扑磷 80.1 8.1 83.5 8.6 86.3 8.1 78.0 8.9 76.7 7.8 79.3 6.8 8 亚胺硫磷 85.3 9.0 81.4 7.1 87.8 6.6 86.6 7.4 89.5 6.3 90.2 5.6 9 甲基对硫磷 75.4 12.0 79.9 9.2 80.2 7.4 77.2 11.0 75.7 9.8 76.0 7.5 10 马拉硫磷 82.0 6.8 89.2 6.7 88.5 5.6 85.0 7.3 82.6 8.2 84.3 6.5 11 氯唑磷 88.3 5.7 87.8 5.2 89.3 5.0 86.1 4.5 88.7 4.7 90.7 4.2 12 水胺硫磷 79.2 7.0 76.5 5.0 78.4 5.7 74.3 6.2 79.3 5.4 82.5 5.8 13 三唑磷 98.6 3.5 94.3 4.5 96.2 3.8 95.0 4.0 92.1 4.3 92.9 6.5 14 灭线磷 77.4 4.3 75.7 4.9 80.3 5.3 80.3 3.8 81.4 5.2 87.4 4.4 15 杀螟硫磷 88.7 5.8 85.0 5.2 88.2 4.2 84.5 5.5 87.5 3.7 82.7 6.1 16 对硫磷 71.5 6.7 73.8 5.1 78.6 7.2 73.2 6.9 78.1 4.8 83.1 5.2 17 伏杀硫磷 70.2 8.0 77.5 6.0 76.4 5.7 73.6 7.0 75.8 6.4 79.4 7.0 18 甲拌磷 75.0 9.9 78.7 5.9 80.9 4.1 78.9 9.2 74.6 8.6 80.6 6.4 19甲基毒死蜱 81.4 9.4 80.1 7.3 85.3 6.4 80.6 8.0 88.7 7.1 82.7 6.0 20 丙溴磷 105.0 6.2 102.0 4.8 97.3 4.4 101.0 5.0 94.6 4.0 90.9 3.7 21 乙硫磷 79.6 7.6 78.3 5.9 76.4 5.0 72.0 6.2 77.3 6.7 74.5 5.4 22 毒死蜱 82.5 8.8 88.3 6.4 91.5 4.6 85.9 9.1 84.9 8.4 87.6 7.1 23 乙拌磷 72.5 8.6 75.3 7.2 77.8 6.5 74.4 8.3 73.6 7.1 78.8 6.2

图1 各样品离子流色谱图Fig.1 Ion current chromatograms of different samples

2.4 实际样品分析

对5份鲜香菇和5份干香菇样品进行测定，其中有1份干香菇检出毒死蜱（0.02mg/kg），其余样品均未检出各种有机磷农药。23种有机磷标样、阳性样品、空白香菇样品、加标样品离子流色谱图见图1。

3 结 论

针对香菇中有机磷测定干扰组分多、热不稳定农药的灵敏度低的难点，建立了23种有机磷的高效液相色谱-串联质谱检测方法。该方法灵敏度高、快速、准确，定量限达到0.01mg/kg，加标回收率在70.2%～105.0%，能满足香菇中多种有机磷农药残留的测定。

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Determination of 23 Organophosphorus Pesticide Residues inLentinus edodesby High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LIANG Da-qing, SU Ken-ming, ZHANG Ju-mei, GUO Wei-peng
(State Key Laboratory of Applied Microbiology, Ministry-Provinc e Jointly Breeding Base, South China, Guangdong Provincial Open Laboratory of Applied Microbiology, G uangdong Detection Center of Microbiology, Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, China)

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectromet ry (HPLC-MS-MS) method was established for the determination of 23 organophosphorus pesticide residues inLentinus edodes. Samples were extracted with acetonitrile and separated by salting out method, and then the supernatants were purified using dispersive solid-phase extraction (C18and primary-secondary amine powder) prior to HPLC-MS-MS analysis. T he analytes were identified in positive electrospray ionization and multiple reaction-monitoring modes. The matrix-m atched external standard calibration curves were used for quantitative analysis. Under the optimal conditions, the li mit of quantitation of the method was 0.01 mg/kg. The recoveries of 23 organophosphorus pesticides in spiked real sam ples were 70.2%–105.0% with relative standard deviation of 3.5%–13.0%. The method presented is sensitive, accurate and fast and can meet the requirements for the determination of organophosphorus pesticide residues inLentinus edodes.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry ; organophosphorus pesticide; residues;Lentinus edodes

TS207.3

A

1002-6630（2014）04-0159-04

10.7506/spkx1002-6630-201404033

2013-06-03

广东省重大科技专项（010A080403005）

梁达清（1979—），男，助理工程师，硕士，研究方向为食品中农兽残检测。E-mail：liangdaqing_200 5@126.com