响应面优化超声波-微波协同提取高粱醇溶蛋白工艺

刘振春，耿存花，孙慧娟，韩 宇

（吉林农业大学食品与科学工程学院，吉林 长春 130118）

高粱（Sorghum bicolor（L.） Moench）是世界主要的粮食作物之一，我国的高粱产量世界排名第二[1]。它营养丰富，是我国的传统食物。据国外研究报道，高粱会给人们带来新的健康理念，由于生长在干旱气候条件下，其含有较多的二十烷醇的多酚复合物和高抗氧化水平的高粱蜡，对健康有独特的益处，尤其对保护心血管的健康至关重要。高粱还含有较多的原花青素[2]，它是一类由黄酮类物质衍生的多酚物质[3]，而谷物里面的多酚物质一直被人们认为是营养的限制性因子[4]。因此高粱这种古老的作物作为21世纪的主要谷物作物引发了人们新的兴趣[5]。高粱种子约含有6%～18%的蛋白质[6]，其中醇溶蛋白是高粱蛋白的主要贮存形式[7]，约占高粱总蛋白质的70%～90%[8]。根据分子质量、氨基酸序列及免疫学的不同又把醇溶蛋白分为3种：α-、β-、γ-醇溶蛋白[9]。醇溶蛋白具有独特的耐热性、成膜性以及抗氧化性，有防潮、阻气、保鲜、抑菌等作用[10]，是比较理想的天然保鲜剂[11-12]。迄今为止，在醇溶蛋白膜研究和开发[13-14]上已投入了大量资源。但它在食品行业中的应用仍相当有限，因此具有广阔的开发前景[15]。

醇溶蛋白的提取主要用乙醇、叔丁醇、异丙醇等有机溶剂提取法[16-17]。也有研究用超临界CO2萃取技术[18]先去除原料中的脂质、色素等杂质。有研究者[19]用86%的异丙醇作为溶剂提取醇溶蛋白，该方法产率高，但是产品有异味，不利于应用于食品加工中[20]，本实验利用乙醇溶液作为提取剂。除此以外，使用超声波或者微波辅助溶剂提取可有效提高醇溶蛋白的得率[21-22]。由于提取醇溶蛋白需要消耗大量的提取剂，生产成本较高，急需优化高粱醇溶蛋白的提取工艺，提高其得率，降低生产成本。本研究采用超声波-微波协同技术提取高粱醇溶蛋白，旨在减少溶剂用量，提高生产效率，为高粱的综合利用和开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高粱 长春市售。

无水乙醇、氢氧化钠、盐酸、DTT（均为分析纯）北京化工厂。

1.2 仪器与设备

FDV超微粉粹机 日本佑崎有限公司；微型植物试样粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；微波炉 美的公司；JY99-2D超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；KDN-消化炉、KDN-08定氮仪 北京通润源机电技术有限责任公司；LXJ-ⅡB离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 提取工艺流程

高粱→粉碎过筛→无水乙醇脱色→离心分离→收集滤饼→75%乙醇→调pH 10.0→超声波处理→微波处理→离心（4 000 r/min，5 min）→取上清液→冷水稀释乙醇体积分数至40%→调pH 6.0→静置24 h→洗涤沉淀→热风干燥→粉碎→高粱醇溶蛋白

1.3.2 蛋白质测定

采用GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法，蛋白质系数为6.25。

1.3.3 高粱醇溶蛋白的鉴定和得率的计算

用紫外分光光度计测成品与高粱醇溶蛋白标准品的紫外吸收图谱，最大吸收波长为278 nm，并与标准比较，判断提取物是否为醇溶蛋白[23]。

1.3.4 单因素试 验

称取5.0 g粉碎所得到的高粱粉末进行实验，分别研究不同的超声功率、超声处理时间、液料比、微波功率、微波处理时间对高粱醇溶蛋白得率的影响。提取的基本条件是：pH 10.0二硫苏糖醇用量1%[24]、75%的乙醇溶液作为提取剂、液料比9∶1（mL/g）、超声功率480 W、超声温度控制在50℃以内、超声处理时间25 min、微波功率450 W、微波处理次数5次（每次45 s，2次处理间隔时间需样液冷却为止）。各因素水平为：超声功率300、360、420、480、540 W；超声时间15、20、25、30、35 min；液料比8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1（mL/g）；微波功率270、360、450、540、630 W；微波处理时间45、135、225、315、405 s。

1.3.5 响应面优化试验方案

采用响应面法进行试验数据处理，选用Box-Behnken模型对影响超声-微波协同技术提取高粱醇溶蛋白得率的因素进行响应面设计，以高粱醇溶蛋白得率为响应值进行优化。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声功率对高粱醇溶蛋白得率的影响

由图1可见，超声功率对高粱醇溶蛋白得率影响较小，醇溶蛋白得率随超声功率的增加而增加，但是当功率超过420 W后，醇溶蛋白得率略有下降，所以选择超声功率420 W提取高粱醇溶蛋白。根据SAS 8.2数据分析软件处理知，P＞0.05，说明超声功率对高粱醇溶蛋白得率影响不显著。

2.1.2 超声时间对高粱醇溶蛋白得率的影响。

图2 超声时间对高粱醇溶蛋白得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on kafirin yield

由图2可知，超声时间对醇溶蛋白得率产生了比较明显的影响，随着时间的延长，高粱醇溶蛋白的得率不断增加，当超声时间为25 min时，得率最高，超过25 min后，得率下降，故选用超声时间为25 min。由SAS 8.2数据分析软件分析，P＜0.05，说明超声时间对高粱醇溶蛋白得率影响高度显著。

2.1.3 液料比对高粱醇溶蛋白得率的影响

由图3可知，在试验选取的液料比范围内，提取液用量少时得率较小，随着提取液用量的增加，得率呈逐渐上升的趋势，但当液料比到10∶1（mL/g）后，得率增势平缓，从节约成本的角度考虑，选择液料比为10∶1（mL/g），这与Watterson等[25]结果相同。根据SAS 8.2软件分析，P＜0.05，液料比对高粱醇溶蛋白得率有显著性的影响。

图3 液料比对高粱醇溶蛋白得率的影响Fig.3 Effect of solvent-to-material ratio on kafirin yield

2.1.4 微波功率对高粱醇溶蛋白得率的影响

图4 微波功率对高粱醇溶蛋白得率的影响Fig.4 Effect of microwave power on kafirin yield

由图4可知，当微波功率为450 W时，得率最大，超过450 W，可能由于强烈的热效应使有效成分遭到破坏，导致得率降低，因此，选取微波功率为450 W。根据SAS 8.2数据分析软件处理知，P＞0.05，说明微波功率对高粱醇溶蛋白得率影响不显著。

2.1.5 微波处理时间对高粱醇溶蛋白得率的影响

图5 微波处理时间对高粱醇溶蛋白得率的影响Fig.5 Effect of microwave treatment time on kafirin yield

由图5可以看出，在微波处理时间为45～225 s范围内时，由于细胞壁破裂程度不断增加，225 s时，细胞破裂程度达到最大，从而使高粱醇溶蛋白得率缓慢上升，在225 s以后，高粱细胞壁基本破壁完全，同时由于持续的加热破坏了高粱醇溶蛋白成分，而使得率下降，所以选微波时间为225 s（即微波处理5次，每次45 s）。由SAS 8.2数据分析软件分析，P＜0.01，说明微波时间对高粱醇溶蛋白得率影响高度显著。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验结果与分析

综合单因素试验结果，选超声时间、液料比、微波时间3个因素，在单因素试验基础上采用三因素三水平利用Design-Expert 7.0软件按照Box-Behnken原理进行响应面设计，根据试验设计确定的试验方案对高粱醇溶蛋白提取进行优化，试验方案及结果见表1。

表1 Box-Behnken试验设计及结果Table 1 Scheme and results of Box-Behnken design

2.2.2 回归方程的建立与检验

根据表1，利用Design Expert 7.0.0软件对试验数据进行回归分析，由此得到超声波-微波协同辅助提取高粱醇溶蛋白得率对超声时间、液料比、微波时间的二次多项回归方程为：Y=6.72＋0.20A＋0.26B＋0.36C－0.075AB－0.088AC＋0.097BC－0.73A2－1.04B2－0.50C2。

通过方差分析从表2可以看出，该模型P＜0.001，表明回二次归方程模型极显著，模型的相关系数R2=0.996 8，校正决定系数R2Adj=0.992 7，表明模型实际值与预测值拟合较好，失拟项P=0.752 6＞0.05，失拟不显著，试验误差较小，因此可用该模型对醇溶蛋白提取试验进行分析和预测。

表2 回归模型各项方差分析Table 2 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial regression mooddeell

由表2可知，各因素对高粱醇溶蛋白得率的影响都极显著，表明超声时间、液料比和微波时间对高粱醇溶蛋白得率影响都很大，交互项中除AB之间不显著，其余均显著，即超声时间与微波时间，液料比与微波时间都存在交互作用，因此表明各因素对高粱醇溶蛋白得率的影响不是简单的线性关系。

2.2.3 双因素交互作用分析

图6 各两因素交互作用对高粱醇溶蛋白得率影响的响应面分析Fig.6 Response surface plots showing the interactive effects of three extraction parameters on kafirin yield

由图6a可以看出，当微波时间固定在225 s时，超声时间和液料比的交互作用不显著，在所选范围内无极值；从图6b可以看出当液料比固定在10∶1（mL/g）时，研究超声时间和微波时间对高粱醇溶蛋白得率的交互影响，由图6b看出，高粱醇溶蛋白得率随着超声时间和微波时间的延长而提高，当超声时间在26 min左右，微波时间在240 s左右时得率最高，超声时间与微波时间对高粱醇溶蛋白得率影响显著，两者对醇溶蛋白得率的提高起到了一定的作用。图6c显示，当超声时间为25 min时，高粱醇溶蛋白得率受液料比和微波时间交互作用影响较大，微波时间短，液料比低，高粱醇溶蛋白得率小，但微波时间过长、液料比过大则会导致高粱醇溶蛋白得率下降。

2.2.4 优化提取工艺参数的验证

采用Design Expert软件，分析得到的最佳工艺条件是：超声时间25.55 min、液料比10.14∶1（mL/g）、微波时间257.30 s，在此条件下高粱醇溶蛋白得率为6.81%。考虑到实际操作的便利，确定提取高粱醇溶蛋白的工艺条件为超声时间为26 min、液料比为10∶1（mL/g）、微波时间260 s，经过3次平行实验，高粱醇溶蛋白的得率为6.79%，与理论值相差不大。

3 结 论

本研究运用响应面法对超声波-微波协同辅助高粱醇溶蛋白提取工艺进行优化，通过Box-Behnken试验设计建立数学模型，并进行响应面分析，结果表明超声时间、液料比、微波时间对高粱醇溶蛋白得率影响均显著，超声时间和微波时间、微波时间和液料比之间的交互作用显著，但超声时间和液料比的交互作用不显著。超声-微波协同辅助高粱醇溶蛋白提取工业条件为超声时间26 min、液料比10∶1（mL/g）、微波时间260 s，在此工艺条件下验证实验，高粱醇溶蛋白得率为6.79%。利用响应面分析方法对超声波-微波协同辅助提取高粱醇溶蛋白提取工艺条件进行优化，可以获得最佳的工艺参数，从而为进一步的实验研究提供依据。

[1]邹剑秋.高粱籽粒的深加工及其加工产业[J].农产品加工, 2005(9): 28-29.

[2]黄朝晖, 陆平, 孟宪军, 等.不同产地高粱的原花青素含量测定及其抗氧化活性分析[J].食品工业科技, 2008, 29(9): 140-144.

[3]方胜, 李里特.静电场对番茄保鲜过程的影响[J].食品科学, 1997,18(1): 5-9.

[4]方胜, 李英杰, 陆守道.高压电场加速食品解冻的探讨[J].食品科学,1999, 20(3): 26-28.

[5]CHUNG O K, BEAN S R, PARK S H, et al.Sorghum.Foods:new health benefits from an ancient grain[C].3rd.Food Science International Symposium, 2004: 18-19.

[6]SHULL J M, WATTERSON J J, KIRLEIS A W.Proposed nomenclature for the alcohol-soluble proteins (Kafirins) ofSorghum bicolor.(L.Moench) based on molecular weight, solubility, and structure[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1993, 39: 83-87.

[7]谭斌.粒用高粱的特性及其在食品工业中开发利用前景[J].粮油深加工及食品, 2007(7): 16-19.

[8]WATTERSON J J, SHULL J M, KIRLEIS A W.Quantitation ofα-,β-, andγ-kafirins in vitreous and opaque endosperm of sorghum bicolor[J].Cereal Chemistry, 1993, 70: 452-457.

[9]郭海峰.高粱种质资源种子醇溶谷蛋白的SDS-PAGE表型多样性[D].太原: 山西大学, 2009.

[10]李秀明, 陈野, 王君予, 等.PPC对挤压成型Zein-PPC复合薄膜性质的影响[J].食品科学, 2012, 33(19): 6-10.

[11]张伟敏, 谭小蓉, 钟耕.高粱蛋白质研究进展[J].粮食与油脂,2005(1): 7-9.

[12]MECITOGLU, YEMENICIOGLU A, ARSLANOGLU A, et al.Incorporation of partially purified hen egg white iysozyme into zein films for antimicrobial food packaging[J].Food Research International,2006, 39(1): 12-21.

[13]陈野, 李鹏, 罗垠.玉米醇溶蛋白/纳米二氧化钛复合膜的制备及性质[J].食品科学, 2011, 32(14): 56-60.

[14]何慧, 王雪刚, 孔林, 等.玉米醇溶蛋白膜在腌肉制品及果蔬中的保鲜作用研究[J].粮食食品科技, 2004(3): 184-187.

[15]姜燕, 唐传核, 温其标, 等.蛋白质膜的研究进展[J].食品研究与开发, 2006, 27(1): 185-188.

[16]王伟, 印丽萍, 陈沁.高粱种子醇溶蛋白的提取条件[J].上海大学学报: 自然科学版, 2007, 13(6): 747-749.

[17]杨光, 杨波, 吴景.不同干燥方法对玉米醇溶蛋白性质影响研究[J].食品科学, 2009, 30(23): 57-59.

[18]王大为, 邵信儒, 张艳荣.超临界CO2萃取对玉米醇溶蛋白提取率及水解度影响的研究[J].食品科学, 2005, 26(8): 166-170.

[19]李远志, 赖江华.玉米食用蛋白高效回收法和用途[J].华南农业大学学报, 1993, 14(2): 111-113.

[20]段纯明, 董海洲.玉米醇溶蛋白的特性及应用研究[J].粮食与食品工业, 2007, 14(1): 29.

[21]李娜, 刘东, 徐怀德, 等.响应面法优化超声波提取玉米醇溶蛋白工艺[J].食品科技, 2012, 37(2): 183-187.

[22]赵华, 王虹, 任晶, 等.响应面法优化微波辅助提取玉米醇溶蛋白工艺研究[J].粮食与油脂, 2010(12): 23-26.

[23]王步江, 刘金福, 张陈云, 等.中心组合设计优化玉米醇溶蛋白的提取工艺[J].中国食品添加剂, 2010(6): 196-199.

[24]PARK S R, BEAN S R.Investigation and optimization of the factors influencing sorghum protein extraction[J].Agricultrue Food Chemistry, 2003, 51: 7050-7054.

[25]WATTERSON J J, BEAN S R, LOOKHART G L.Factors influencing the characterization of giuten proteins by SEC-Malls[J].Cereal Chemistry, 2001, 78: 608-618.