替米沙坦通过上调PPAR－γ促进结肠癌SW480细胞TIMP－1表达的实验研究

尹 鹏，胡 君，储著凌，霍中华，侯乐伟，吕 盛，栾荣刚，胡国强

（解放军第四五四医院普外烧伤整形外科，江苏 南京 210002）

结肠癌（colon cancer）是最常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来发病率和死亡率逐年增加［1～3］。浸润和转移是恶性肿瘤最主要的生物学特征，也是影响治疗效果和预后的主要因素［1～3］。目前的研究发现，氧化物酶体增殖激活受体γ（peroxisome proliferatorsactivated receptor gamma，PPAR－γ）对于肿瘤细胞的转移和增殖过程具有重要的调节作用［4，5］。同时发现血管紧张素受体1（AT1R）阻断剂（ARB）如替米沙坦和厄贝沙坦等，能够有效促进PPAR－γ的合成［6］。同时研究证实，PPAR－γ对组织抑制剂－1（TIMP－1）的表达有重要的调节作用。本实验的目的是观察ARB是否能够通过上调PPAR－γ的表达促进结肠癌SW480细胞TIMP－1的表达和对细胞增殖的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和材料 PCR试剂盒购自宝生物工程有限公司；鼠抗人TIMP－1抗体、鼠抗人PPAR－γ抗体和鼠抗人β－actin抗体购于美国Santa Cruz公司；替米沙坦（美国Sigma公司），DMEM培养基（美国Gibco公司），小牛血清（杭州四季青）；MTT试剂盒（美国Promega公司），超纯水；其余试剂均为分析纯。

1.2 细胞培养 SW480细胞常规接种在含10%胎牛血清、100g／L 青霉素、100g／L 链霉素的 RPMI 1640培养液中，置于37℃、95%空气、5%CO2孵箱内培养。每48小时换液、传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 细胞活性检测 取对数生长期细胞消化制成单细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔接种100μl约含5×103个细胞。贴壁后无血清培养细胞16～24h，使细胞同步化。空白对照组加入PBS，阳性实验组加入替米沙坦，终浓度为100μmol／L （100μM），在37℃、5%CO2条件下培养细胞。使用MTT比色试验对不同时间点 （0、24和72h）的细胞生长状态进行测定，实验重复4次。细胞活性（%）＝ （OD干预组／OD对照组）×100%［7］。

1.4 细胞TIMP－1和PPAR－γmRNA表达检测 按照RT－PCR试剂盒说明书提取细胞总RNA。以2μg总RNA为模板，用Oligo（dT）18作为引物，按照试剂盒说明书介绍要求合成cDNA第1链。TIMP－1正义 5′－GCAACTCCGACCTTGTCATC－3′，反 义 5′－AGCGTAGGTCTTGGTGAAGC－3′；PPAR－γ 正 义5′－TCTCTCCGTAATGGAAGACC－3′， 反 义 5′－GCTGTCACCTTCACCGTTCC－3′；β－actin 正 义：5′－CTCCATCCTGGCCTCGCTGT－3′，反 义：5′－GCTGTCACCTTCACCGTTCC－3′，PCR反应体系如下：2 μl逆转录产物模板、PCR Master Mix（2×）25μl、正反引物各2μl，以超纯水补充至50μl。PCR反应条件为：96℃5min；91℃30s，56℃60s，73℃60s，循环35轮，最后74℃延伸10min。PCR产物8μl与5×loading buffer 2μl混匀后，1.2%琼脂糖凝胶20V／cm电压进行电泳约30min。应用凝胶成像系统（Biorad）摄影，Quantity One软件对目的条带进行扫描分析。用与β－actin PCR产物条带灰度比值作为TIMP－1和PPAR－γmRNA的相对表达量。

1.5 Western blot法检测细胞中TIMP－1和PPAR－γ蛋白表达 按照试剂盒操作要求，首先提取细胞总蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE），然后转移至硝酸纤维素滤膜上，用脱脂奶粉封闭1小时，分别加入鼠抗人单克隆抗 体 TIMP－1 （1∶500）、PPAR－γ（1∶400）和β－actin（1∶1500），4℃孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2000），用ECL进行显色，用凝胶成像分析系统进行扫描。

2 结果

2.1 MTT法细胞活性测定结果分析 干预时间0、24、72小时时细胞活性依次为98.0±3.5、62.1±18.6和29.8±11.2，结果显示，随时间变化，替米沙坦组SW480细胞活性逐渐减低，明显低于对照组（均P＜0.05），且各时间点间的细胞活性存在显著统计学差异（均P＜0.05）。

2.2 TIMP－1和PPAR－γmRNA 的表达 在给予替米沙坦干预后，在0、24和72h时对SW480细胞TIMP－1和 PPAR－γmRNA 的表达显示，TIMP－1和PPAR－γmRNA的表达呈时间依赖性递增（均P＜0.05），见表1、图1。

表1 TIMP－1和PPAR－γmRNA的表达（n＝4，）Table 1 The mRNA expression of TIMP－1and PPAR－γin SW480cells

表1 TIMP－1和PPAR－γmRNA的表达（n＝4，）Table 1 The mRNA expression of TIMP－1and PPAR－γin SW480cells

注：①与0h比较，P＜0.05；②与24h比较，P＜0.05

干预时间0h 24h 72h TIMP－1mRNA 0.18±0.02 0.58±0.07① 0.72±0.19①②PPAR－γmRNA 0.21±0.06 0.42±0.12① 0.89±0.21①②

图1 TIMP－1和PPAR－r mRNA的表达Figure 1 The expression of TIMP－1and PPAR－r mRNA

2.3 TIMP－1和PPAR－γ蛋白的表达 在给予替米沙坦干预后，在0、24和72h时对SW480细胞TIMP－1和PPAR－γ蛋白表达显示，TIMP－1和 PPAR－γ蛋白表达呈时间依赖性的递增（均P＜0.05），见表2。

表2 TIMP－1和PPAR－γ蛋白表达（n＝4，）Table 2 The protein expression of TIMP－1and PPAR－γin SW480cells

表2 TIMP－1和PPAR－γ蛋白表达（n＝4，）Table 2 The protein expression of TIMP－1and PPAR－γin SW480cells

注：①与0h比较，P＜0.05；②与24h比较，P＜0.05

干预时间0h 24h 72h TIMP－1蛋白 0.24±0.03 0.52±0.11① 0.76±0.13①②PPAR－γ蛋白 0.19±0.05 0.39±0.06① 0.81±0.19①②

图2 TIMP－1和PPAR－r蛋白的表达Figure 2 The expression of TIMP－1protein

3 讨论

目前由于饮食结构和生活习惯的改变，结肠癌以成为导致人类癌症死亡的最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年升高，同时流行病学调查显示结肠癌的发病人群有年轻化趋势［1～3］。

侵袭和转移是恶性肿瘤最明显的特征，也是导致肿瘤复发的重要原因。目前对于以抑制肿瘤转移为目标的研究方兴未艾，是肿瘤研究的热点之一。肿瘤细胞侵袭转移到邻近组织及远处器官是一个多步骤的复杂过程。肿瘤细胞首先必须具备降解细胞外基质（extracellular matrix ECM）及基底膜（basement membrane，BM）的功能，而这个降解功能主要有蛋白水解酶完成。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是蛋白水解酶中重要的一类。近年发现，MMPs主要是通过对基底膜（BM）和ECM的降解和增强肿瘤血管的生成促进肿瘤细胞的侵袭、浸润和转移。MMPs超家族具有相似的基本结构包括前肽区域、信号肽区域、催化活性区域、类血红素蛋白结合区、ECM 同源序列区域和铰链区［8，9］。组织抑制剂（TIMPs）是近年来发现的抑制MMPs活性的多功能因子家族，是一组低分子量的糖蛋白，主要由成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞等合成和分泌。已发现的TIMPs酶有5种，为组织中MMPs主要的内源性抑制因子，能特异地抑制MMPs家族的基质降解酶。TIMP－1是TIMPs中的一种，研究发现在多种肿瘤细胞中呈现高表达，并认为TIMP－1的表达与肿瘤细胞的分化程度、浸润和转移能力密切相关［9，10］。TIMP－1具有IV型胶原酶的作用，对IV型胶原和纤维连接蛋白（FN）有降解作用。TIMP－1的表达和活化可以受基因转录、酶原活化和抑制剂等多水平的调控［9，10］。研究发现PPAR－γ在TIMP－1的表达调控过程中扮演着重要的角色［11］。

过氧化物酶体增殖激活受体γ（peroxisome proliferators－activated receptor gamma，PPAR－γ）属于PPAR的亚型之一，可通过蛋白－蛋白相互作用和竞争辅助因子调控核转录因子－κB（NF－κB）、转录激活因子（STAT）和活化蛋白－1（AP－1）等多个重要的肿瘤发生发展相关的核转录因子，进而对多种肿瘤细胞的侵袭、转移、增殖和凋亡等过程起调节作用［4～8］。进一步研究还发现，PPAR－γ在包括肺癌等多种恶性肿瘤中表达明显下降，同时发现上调PPAR－γ的表达可以有效的促进包括A549细胞和Hela细胞等多种肿瘤细胞的凋亡，抑制多种与肿瘤转移和浸润相关分子（如 MMPS和 VEGF等）的合成和表达［4～8］。目前PPAR－γ已成为治疗肿瘤的热点。

多个研究发现，血管紧张素受体1（AT1R）阻断剂（ARB）可以有效地上调PPAR－γ的表达抑制炎症反应和肿瘤的生长，并认为该过程可能与血管紧张素系统（RASS）无关［6］。在我们的研究中，发现在给予SW480细胞替米沙坦100μmol／L干预后，SW480细胞活性呈时间依赖性降低。该结果表明，替米沙坦具有抑制SW480细胞增殖的作用。进一步使用PTPCR和western blot分析发现SW480细胞TIMP－1和PPAR－γmRNA和蛋白表达在替米沙坦干预后呈时间依赖性降低。该结果表明替米沙坦可以通过促进TIMP－1的表达抑制SW480细胞的粘附和侵袭能力，并可能与上调PPAR－γ的表达密切相关。

4 结论

本实验结果表明，替米沙坦可能通过上调SW480细胞中PPAR－γ的表达促进TIMP－1的合成，并导致肿瘤的生长和侵袭能力的降低。但具体的机制还有待进一步研究。

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