盲肠结扎穿刺致脓毒性肺损伤大鼠血清MMP－9水平研究＊

陈 昊 ，李晓宁，薛 菲，王 岸，周 超

（上海市周浦医院呼吸内科，上海 201318）

急性肺损伤（ALI）／急性呼吸窘迫综合征（ARDS）死亡率达 32%～50%［1］。脓毒症是 ALI／ARDS的重要病因，脓毒症时基质金属蛋白酶（MMPs）激活可能是肺损伤的重要因素［2～4］。目前国内对脓毒性肺损伤MMP－9的研究未见报道。本试验通过盲肠结扎穿刺研究大鼠脓毒性急性肺损伤MMP－9的血清表达以及肺损伤病理相关性，探讨MMP－9在ALI形成及预后判断的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠50只，体重230～250g，购自第二军大医学实验动物中心。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及处理 50只SD大鼠完全随机分为假手术组（SHAM组）8只和CLP手术组42只（6、12、24、48h）。6、12h组各8只，24h组10只和48h组16只。CLP组分别在设定时间处死仍存活的大鼠；SHAM组在48小时后处死作为对照组。

1.2.2 建立CLP致急性脓毒症性肺损伤动物模型

1.2.2.1 手术组（CLP组） 适应性饲养实验动物1周，在手术前禁食12h。戊巴比妥纳按40mg／kg剂量、腹腔注射麻醉后，将仰卧位大鼠固定在手术板，在中腹手术区去毛和消毒后，用手术刀经腹壁行一约2cm切口，进腹后在以3号丝线在回盲瓣末端分离并结扎盲肠，用50ml针筒针头在结扎末端穿刺3次，并挤出少许粪便，然后用4号丝线依次逐层缝合腹膜至皮肤。手术完成后皮下注射NS 100ml／kg抗休克。手术组在6、12、24和48h处死实验大鼠，并留取实验标本。

1.2.2.2 假手术组（SHAM 组） 在开腹后仅翻动肠道后关腹，不予手术结扎穿刺及皮下注射NS补液。

1.3 评价指标测定

1.3.1 生存率 记录各实验组大鼠的实际生存率。

1.3.2 标本采集

1.3.2.1 血清标本采集 在预定时间点处死实验动物取血置于抗凝管管中，使用低温离心机（2000r／min）离心30分钟，取血清后立即冻存在－80℃冰箱中，留待炎症因子测定。

1.3.2.2 肺组织标本 预定时间点处死实验组动物后，在无菌条件下开胸取肺，迅速用吸水纸吸取左肺表面水分以及血液，使用电子天平称重，迅速置于90℃烤箱烘干72小时后，再次称取干重，并计算肺组织的干／湿重比（W／D）。右肺下叶用10%甲醛固定，留待病理学检查评分。

1.3.3 炎症因子测定 MMP－9、IL－8、IL－10、IL－1测定，采用双抗体夹心E L I S A法检测，试剂盒均购自上海西塘公司。

1.3.4 病理检查 取开胸后留存右肺下叶用10%福尔马林固定后石蜡包埋切片，HE染色，观察肺组织病理。参照Smith评分法［5］的方法并进行病理评分。

2 结果

2.1 生存率 CLP手术后48小时组大鼠的生存率为31.2%，24小时生存率为60%，12和6小时均无死亡。假手术组无死亡。

2.2 W／D比 对照组W／D水平在CLP手术后6和12小时出现下降（P＜0.01），6和12小时组间无明显差异（P＞0.05）。24小时组 W／D水平仍下降，同12小时组相比，差异有显著性（P＜0.01）。48小时组W／D水平出现上升，同24小时组间无统计学差异（P＞0.005），见表1。

表1 肺干湿重比（W／D）比较（）Table 1 W／D of the lung

表1 肺干湿重比（W／D）比较（）Table 1 W／D of the lung

肺病理评分SHAN组 4.62±0.56①分组 W／D 0.67±0.5166h 4.63±0.11① 0.60±0.54812h 4.37±0.13 1.25±0.50024h 4.47±0.09 2.67±0.51648h 4.86±0.04 3.60±0.548

2.3 在本实验中，MMP－9、IL－8、IL－1、IL－10血清水平变化及统计结果见表2。

表2 盲肠结扎穿刺术后各组血清水平变化情况（）Table 2 MMP－9，IL－8，IL－6and IL－10after CLP

表2 盲肠结扎穿刺术后各组血清水平变化情况（）Table 2 MMP－9，IL－8，IL－6and IL－10after CLP

分组 IL－1（pg／ml） IL－8（pg／ml） IL－10（pg／ml） MMP9（pg／ml）SHAH 组 8.59±7.21 150.15±43.99 13.08±7.61 12.15±5.666h 43.46±25.33 1394.92±109.98 22.52±8.35 9.50±1.8112h 58.84±35.48 1665.12±256.45① 53.09±57.83① 12.47±2.5024h 59.47±37.06 2201.55±147.39② 61.00±20.61② 31.80±3.62②48h 141.33±68.58② 3582.41±2304.93② 60.99±40.09② 45.27±21.38②

2.3.1 CLP手术组大鼠12、24hMMP－9与对照组相比明显上升（P＜0.01），48小进一步升高（P＜0.01），见图1－1。

2.3.2 CLP手术组大鼠IL－8各个时间点有持续升高趋势，12小时组较对照组升高（P＜0.05），24及48小时组较对照组显著升高（P＜0.01），见图1－2。

2.3.3 CLP手术组大鼠0～24小时IL－1有持续升高趋势，48小时组较对照组显著升高（P＜0.01），见图1－3。

2.3.4 CLP手术组大鼠，12、24、48hIL－10同对照组相比均升高（P＜0.05），而12、24及48h组未有进一步升高趋势，见图1－4。

图1 水平示意Figure 1 MMDP，IL－8，IL－1and IL－10

2.4 病理情况 对照组及假手术组光镜下观察，对照组肺组织结构完整，未有明显炎症以及水肿变化。CLP手术后随造模时间延长肺损伤进行性加重。6小时组未见明显的肺组织变化；12小时组可见轻微的肺间质增宽，未有明显水肿、渗出及少量炎性细胞浸润；24小时组出现肺泡间隔增宽，肺泡腔塌陷，出现大量炎性细胞浸润，红细胞渗出，并有支气管内出血，肺泡结构破坏，见图2、3。48小时组肺泡间隔增宽进一步加重，大量肺泡组织结构破坏，出现局灶性肺不张和肺气肿，肺泡间结缔组织出现明显增生，仅少量炎性细胞浸润，肺泡间出现少量液体渗出，见图4。病理评分前12小时无明显变化（P＞0.05），12、24和48h出现增高（均P＜0.01），病理组织评分见表2。

图2 CLP后24小时肺组织病理 炎症细胞浸润（HE染色，×100）Figure 2 Inflammatory cell infiltration 24 hour after CLP

图3 CLP后24小时肺组织病理 肺出血（HE染色，×100）Figure 3 Pulmonary hemorrhage 24hour after CLP

图4 CLP后48小时肺组织病理（HE染色，×100）Figure 4 Pulmonary pathology 48hafter CLP

2.5 相关性研究 分别对各组数据进行正态性检验，均为正态分布。然后行Pearson相关性分析，再行相关系数的假设检验。MMP9等炎症因子同肺损伤病理评分相关系数（MMP9、IL1、IL8均P＜0.01，IL－10 P＜0.05）MMP9的相关性最高（r＝0.704，P＜0.01），见表3。

表3 MMP－9等炎症因子同肺损伤病理相关性分析Table 3 The relation of inflammatory factors and pathology of pulmonary injury

3 讨论

3.1 脓毒症性肺损伤动物模型的建立 ALI／ARDS临床特征是难以纠正的低氧血症。细胞因子在脓毒症性肺损伤中其关键性作用。既往动物实验研究以使用直接建立肺损伤的模型方法较多，包括注射油酸、盐酸吸入等直接建立肺损伤模型的方法。直接肺损伤因素诱发肺损伤出现的时间以及病理过程同脓毒性肺损伤的特征有明显区别，本实验主要的研究内容是脓毒症后的肺损伤，故不考虑使用。而目前脓毒症模型有内因性中毒模型和细菌感染模型两种。前者以LPS腹腔注射为主，后者一般使用盲肠结扎穿刺（CLP）手术的方法。在研究脓毒症继发肺损伤的动物模型选择上使用CLP更接近于临床实际［6］。

本实验24小时大鼠生存率60%，48小时生存率31.2%，同国外的实验模型研究的结果基本相同［7］。IL－1、IL－8、IL－10等肺损伤相关炎症因子明显升高。更重要的是肺组织病理评分随时间增加。24小时组及48小时组出现肺泡结构破坏，出现肺泡腔塌陷，出现大量炎性细胞浸润，气管内出血，局灶性肺不张和肺气肿等肺损伤变化。根据肺病理我们考虑大鼠脓毒症后明显肺损伤出现于24小时，并在48小时出现肺损伤。脓毒症后肺损伤的模型可以通过该方法建立。

3.2 细胞因子变化 目前文献报道与肺损伤有明确关系的炎症因子主要包括白介素（IL－1、IL－8、IL－10）［8～10］。而本研究中同样发现以上炎症因子均出现明显升高。各种炎症因子高峰在24～48h出现，表明IL－1等均参与了肺损伤的病理过程。相关性分析表明，IL－10与肺损伤显著相关。本实验中IL－10在12小时已出现高峰，肺损伤出现后IL－10水平无明显变化。IL－10对免疫应答起抑制作用，有实验表明急性肺损伤患者肺组织中IL－10水平降低提示可能发生急性呼吸窘迫综合征。IL－10具有明显的对抗淋巴细胞和中性粒细胞等炎症细胞在肺组织中浸润作用，从而减轻肺损伤［11］。本实验中存活大鼠的IL－10水平持续不下降，也说明IL－10可能抑制脓毒性肺损伤。

IL－1、IL－8与肺病理评分的结果有较高的相关性。IL－1、IL－8和 MMP－9均在24小时后出现进一步升高。炎症细胞在肺内早期聚集的趋化因子是IL－1，IL－1合成后一部分进入血流，吸引激活各种炎症细胞并能诱导IL－8产生；IL－8对炎症细胞有强力的趋化作用。IL－8同其他炎症因子的区别在于持续升高，48小时仍有明显继续升高。在CLP后48小时肺损伤的病理已经转为慢性的炎症变化，炎症细胞浸润明显减少，增生开始增多。而IL－1和IL－8脓毒症中主要作用为趋化炎症细胞浸润，这说明脓毒性肺损伤后期MMP－9可能起到更重要的作用［12］。我们认为脓毒症后期IL－1和IL－8水平增高能诱导MMP－9的表达，并造成肺损伤的进展。

3.3 MMP－9表达的变化 我们发现，MMP－9与肺病理损伤相关性最高。MMP－9与肺损伤的相关系数高于IL－1、IL－8、IL－10。MMP－9在 CLP手术24小时后才出现明显上升，与IL－1、IL－8和IL－10的表现有明显区别。CLP后24小时MMP－9与肺损伤同步出现，并在大鼠出现肺损伤的48小时有进一步升高。

在脓毒症发生后，MMP－9活性的升高能够大量降解肺泡上皮细胞外基质，并导致肺泡渗出液大量产生，炎症介质的进一步释放，引起急性肺损伤的发生。有动物实验研究表明，MMPS在急性肺损伤中水平升高，肺泡内的免疫复合物诱导了肺损伤；MMP－9还影响对于炎症细胞通过细胞外基质、基底膜以及内皮细胞层来控制气道的炎症［13，14］。另有研究表明，MMP－9同时可以裂解各种细胞因子和促炎因子，转化为更为强力的炎症因子，MMP－9在免疫反应中起着调节和放大的作用［15］。在本实验中 MMP－9的增高同肺病理损伤的发展是同步的。

MMP－9在脓毒症发生后能降解内皮细胞的基质，同时还可以破坏细胞基底膜、内皮细胞层和细胞外基质，刺激肺泡液渗出同时释放大量的炎症介质。另外MMP－9还可以增强炎症因子效应，诱导中性粒细胞迁移并在肺组织浸润，刺激肺成纤维细胞，以及肺泡Ⅱ型上皮细胞、血管内皮细胞的实质细胞，再次释放出 MMPs，从而放大了肺组织的损伤。MMP－9可能在脓毒症继发的肺损伤中起到了关键性的作用。

既往文献报道，肺损伤发生后W／D水平上升，本实验结果同实验预计不相符。我们考虑在重度CLP后，大鼠出现严重脓毒症出现血管扩张和血液分布异常，血管内皮细胞完整性破坏以及微血栓形成均可以引起血浆外渗有效循环血量不足。同时脓毒症后大鼠处于高代谢状态，体液消耗增快。而重度CLP大鼠我们观察到在术后早期是停止进食饮水，虽然已经进行皮下的常规补液，但结合术后24小时大鼠平均15g以及术后48小时35g的体重下降。在重度CLP下，常规补液量可能是不充足的。大鼠在无有效补充液体情况下出现严重休克，由于严重的休克出现未出现明显肺水增加，W／D在前24小时出现下降，而在24小时后大鼠开始饮水休克得到一定代偿，在24～48小时出现W／D升高。

4 结论

CLP手术后大鼠24小时出现明显肺损伤，48小时生存大鼠均可以出现严重肺损伤。MMP－9同肺损伤的相关性比IL－1、IL－8、IL－10更明显。MMP－9的水平上升可能提示肺损伤的发生。MMP－9可能在脓毒症后肺损伤的形成过程中扮演着关键性角色。

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