人心房利钠肽对机械通气肺损伤大鼠肺组织NF－κBp65的表达及影响＊

季艳梅，郑 翔，张浩明，方志成，郭家龙

（湖北医药学院附属十堰市太和医院重症医学科，湖北 十堰 442000）

机械通气是救治急性肺损伤或者呼吸衰竭等危重症的有效措施之一。但随着机械通气的应用，我们发现它本身可诱发或加重肺损伤，即机械通气所致肺损伤（VILI）。人心房利钠肽（ANP）一种活性多肽，具有利钠、利尿、扩张血管、调节体液平衡、抑制炎性介质释放等多种作用［1］。本研究拟观察机械通气损伤大鼠肺组织NF－κB，肺水含量及相关细胞因子表达的改变，探讨ANP对VILI的治疗作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 试剂 人心房利钠肽（批号：S21535－312，Sigma公司，德国）；大鼠TNF－α及IL－1βELISA检测试剂盒（ADL公司，美国）；NF－κB P65多克隆抗体（Santa cruze公司，美国）。

1.2 动物分组与模型制备 湖北医药学院实验动物中心提供Wistar大鼠30只 ，随机分为3组，对照组（TV组，潮气量8ml／kg）、机械通气肺损伤组（HV组，潮气量40ml／kg）和hANP预处理组，于机械通气30min后静脉注射hANP（0.1g／kg·min）。由左股静脉置管输液，给药，间断静脉注射顺式阿曲库铵维持肌松。气管切开后插入气管导管，接HX－300小动物呼吸机行机械通气，呼吸频率40bpm，吸呼比1∶1，吸入气体为空气。TV组和HV组于相同时点静脉注射等体积生理盐水。

1.3 标本采集及检测方法 机械通气4小时时静脉注射氯化钾处死大鼠。

1.3.1 肺组织核蛋白提取及定量 取右下肺叶肺组织约100mg，，充分洗涤，加入裂解缓冲液A，冰上放置15～30min，，电动匀浆后加入500μl 10%Nonidet P－40，涡旋，离心30s，上清为细胞浆蛋白。取沉淀物洗涤，离心30s，弃上清。加入核蛋白提取裂解液B，冰上放置30min，然后离心，吸出上清（核蛋白），Bradford比色法测定核蛋白浓度，并调至0.5～1.0μg／μl，置于－70℃保存。

1.3.2 免疫蛋白印迹法（western blot）测定 NF－κB P65的表达 用组织蛋白提取试剂盒，在冰上操作，收集细胞离心、弃培养液、洗涤细胞，按1×109／L加入细胞蛋白裂解液，BCA试剂盒蛋白定量。各组标本加入蛋白上样缓冲液后95℃加热5分钟，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉室温封闭1小时后加入抗NF－Κb P65I抗，孵育过夜，洗涤3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG（H＋L，1∶5000稀释），常温孵育1小时；ECL发光显色，暗室曝光，显影，洗片。用HPIAS2000型图像分析软件（北京航天航空大学）进行图像分析，以平均灰度值表示NF－κB P65的表达水平。

1.3.3 细胞因子的测定 肺组织置于4℃缓冲液中，制成匀浆，离心取上清，用大鼠ELISA试剂盒分别测定 TNF－a和IL－lβ含量。

1.3.4 肺组织湿／干重比（W／D） 将左肺下叶组织用滤纸吸干水分，在分析天平上精确称湿重（W）后放入80℃烤箱，烘烤48小时后称干重（D），计算肺组织湿／干重比（W／D）。

1.4 统计学处理 用SPSS 13.0软件处理数据，计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 机械通气肺损伤模型的复制 大鼠高气道压机械通气后，心率增快，血氧饱和度下降，严重者在实验中途死亡。病理学检查肺损伤明显，有明显的炎症细胞聚集，部分肺泡腔出血、广泛渗出，见图1。

图1 肺损伤模型Figure 1 Model of pulmonary injury

2.2 3组肺组织 NF－κB P65表达及 TNF－a、IL－lβ水平比较 与TV组相比，HV、HV＋hANP组肺组织NF－κB P65表达明显增加，HV、HV＋hANP组肺组织 TNF－a、IL－lβ含量明显上升（P＜0.05），肺组织 W／D升高（P＜0.05）；与HV组相比，HV＋hANP组肺组织 NF－κB P65表达明显抑制，肺组织 TNF－a、IL－lβ含量明显降低（P＜0.05），肺组织 W／D明显降低（P＜0.05），见表1。各组大鼠肺组织NF－κB P65免疫印迹法结果见图2。

图2 各组大鼠肺组织NF－κB P65免疫印迹法结果Figure 2 Immuneblot of NF－κB P65in lung tissue in each group

表1 3组肺组织NF－κB P65表达、W／D及TNF－a、IL－lβ水平比较（，n＝10）Table 1 Comparison of NF－κB P65，W／D and TNF－a，IL－lβin lung tissue in the four groups

表1 3组肺组织NF－κB P65表达、W／D及TNF－a、IL－lβ水平比较（，n＝10）Table 1 Comparison of NF－κB P65，W／D and TNF－a，IL－lβin lung tissue in the four groups

注：与TV组比较，①P＜0.05；与 HV组比较，②P＜0.05

组别 肺组织 W／D NF－κB P65 TNF－a（pg／ml） IL－lβ（pg／ml）TV组4.1±0.5 139±10 124.26±10.18 126.62±10.73 HV组 9.7±1.2① 238±24① 519.22±35.31① 751.82±65.35①HV＋hANP组 6.4±0.9①② 178±14①② 283.54±24.16①② 316.29±25.65①②

3 讨论

从本质上说，气压伤实际上是容积伤。本研究通过高气道压通气成功复制 VILI模型，结果表明，与TV组相比，HV 组肺组织 TNF－a、IL－lβ含量上升，W／D比值升高，病理学检查肺损伤明显，有明显的炎症细胞聚集，部分肺泡腔出血、广泛渗出，表明肺通透性增加，病理损伤加重，提示大鼠机械通气肺损伤模型制备成功。

VILI的临床表现多样，主要包括气压伤、肺水肿等，其发病机制错综复杂［2］。本研究中HV组肺组织W／D比值升高，病理学检查肺间质水肿明显，表明肺水含量明显增加，提示肺水肿是导致机械通气肺损伤的主要因素。同时本实验亦发现HV组TNF－a、IL－lβ含量上升，病理学检查炎症细胞聚集，表明促炎因子过度激活，细胞因子失衡，是VILI发生、发展的重要因素。分析其原因，可能为机械通气吸气相引起肺泡扩张，导致较大的牵拉肺泡毛细血管的纵向张力，使毛细血管内皮细胞及上皮细胞损伤，通透性增加，富含蛋白的血浆成分漏出，导致肺水肿。血浆成分的漏出可诱发炎症反应，进而从上游水平激发炎症“瀑布”，TNF－α等前炎症因子与肺血管内皮细胞相互作用，从而引起炎性反应放大和粘附分子的增加［4］。NF－κB P65是诱导许多基因表达的重要调节因子。本研究 NF－κB P65表达的增加，说明它被 TNF－a、IL－lβ等炎性细胞因子激活，而与p38MAPK共同组成释放炎症因子的关键信号通路，反之又可诱导炎性细胞因子表达，从而广泛参与炎症介质和前炎症介质、黏附分子、趋化因子和一些炎性相关酶等基因的调控，在VILI的疾病演进过程中起到一定的作用［5］。研究抑制NF－κB P65产生及生物活性的药物，可能是治疗机械通气肺损伤的一个重要环节。

人心房利钠肽（ANP）是一种活性多肽，具有利钠、利尿、扩张血管、调节体液平衡、抑制炎性介质释放等多种作用。本研究HV＋hANP组肺组织W／D降低，说明使用hANP预处理后肺水含量明显降低，与人心房利尿钠肽的利钠、利尿、调节体液平衡，扩张血管的作用密不可分［4］。同时肺组织 NF－κB P65表达降低，肺组织TNF－a、IL－lβ含量降低，提示静脉使用ANP可抑制NF－κB的表达进而减轻机械通气大鼠肺部的炎症反应。分析其原因，可能为人心房利钠肽（ANP）通过抑制炎性介质释放等多种作用使得使得细胞内氧化 －还原状态发生改变，超过了细胞的自身调节能力，氧化还原状态失衡，进而抑制NF－κB的活性 ，最终抑制了包括TNF－a、IL－lβ等在内的炎症介质的释放［5］。由此可见，在炎症反应中NF－κB的活化对于调节促炎、抑炎平衡起关键作用，维持NF－κB的正常活性对于减少炎症失衡所致的结构细胞损伤有重要意义。因此，ANP的抗炎、保护脏器的作用可能是通过降低细胞内GSSG水平进而抑制NF－κB的活性而实现的。

4 结论

ANP在机械通气诱导的大鼠ALI中具有重要的保护作用，其作用机制可能是抑制NF－κB的激活来缓解炎症反应，使细胞因子、黏附因子、趋化因子、生物活性酶等炎症介质表达减少，从而达到治疗的效果。

［1］Levin ER，Gardner DG，Samson WK ，et al.Natriuretic Peptides［J］.N Engl J Med，2008，339（5）：321－328.

［2］Zhu YB，Zhang YB，Liu DH，et al.Atrial natriuretic peptide attenuates inflammatory responses on oleic acid－induced acute lung injury model in rats［J］.Chin Med J（Engl），2013，126（4）：747－750.

［3］Koga H，Hagiwara S，Shingu C，et al.Human atrial natriuretic peptide ameliorates LPS－induced acute lung injury in rats ［J］.Lung，2010，188（3）：241－246.

［4］付 婧.不同机械通气模式对急性肺损伤患者呼吸及血流动力学的影响［J］.中国医药导报，2012，9（23）：45－49.

［5］Oda J，Kasai K，Noborio M，et al.Effect of intravenous atrial natriureticpeptideon pulmonary dysfunction and renal function following burn shock［J］.J Trauma，2009，66（5）：1281－1285.