黄芪建中汤对慢性阻塞性肺疾病稳定期大鼠mtDNAATPase6、ATPase8基因表达的影响

魏姗姗　徐升　张念志

摘要：目的探讨黄芪建中汤对慢性阻塞性肺疾病（COPD）稳定期大鼠mtDNA ATPase6、ATPase 8基因表达的影响。方法将120只SD大鼠随机分为6组：即A组（正常对照组）、B组（COPD模型组）、C组（黄芪建中汤高剂量组）、D组（黄芪建中汤中剂量组）、E组（黄芪建中汤低剂量组）、F组（金水宝胶囊组），每组20只。后五组采用气管内注射脂多糖（LPS）加烟熏的方法制作COPD大鼠模型，造模成功后，各治疗组分别给药8周，采用RT-PCR方法检测大鼠动脉血mtDNA ATPase6、ATPase 8基因表达变化。结果A组的荧光生长曲线呈明显阳性；B组大鼠mtDNA ATPase 6、ATPase 8荧光反应较A组明显下降（P<0.01）；与B组相比：C组、D组、E组、F组荧光反应明显升高（P<0.01），升高的次序为C组>D组>F组。C组与D组之间差异显著（P<0.05），D组与E组之间差异显著（P<0.05），C组、D组与F组之间差异显著（P<0.05）。结论模型组大鼠mtDNA ATPase 6、ATPase 8基因表达量减少，黄芪建中汤对mtDNA ATPase 6、ATPase 8的基因表达有明显的保护与恢复作用，疗效优于金水宝胶囊组。

关键词：COPD；黄芪建中汤；mtDNA ATPase6、8

中图分类号：R563.9文献标志码：A文章编号：1007-2349（2014）05-0071-03

【Abstract】Objective：To study the effect of Huangqi Jianzhong Decoction（HJD）on mtDNA ATPase 6，ATPase 8 gene expression of chronic obstructive pulmonary（COPD）in stationary phase. Methods：120 SD rats were randomly divided into six groups，Group A（control group），Group B（COPD model group），Group C（HJD high-dose group），Group D（HJD medium-dose group），Group E（HJD medium low-dose group），Group F（Jinshuibao Capsule group），20 rats per group. The latter five groups were given with LPS intratracheal injection plus smoked way to induce COPD rats. Each of the treatment group was administered for 8 weeks. RT-PCR method was used to detect the changes of the mtDNA ATPase 6，ATPase 8 gene expression of arterial blood of the rats. Results：The fluorescence growth curve of Group A was significantly positive，the fluorescence response of the mtDNA ATPase 6、ATPase 8 of Group B was significantly lower than that of Group A（P<0.01）. Compared with Group B，the fluorescence response of Group C，D，E，F was significantly higher（P<0.01），and their increase order was Group C>Group D>Group F. The difference between Group C and D was significant（P<0.05），the difference between Group D and E was significant（P<0.05），the difference between Group C，D and E was significant（P<0.05）. Conclusion：The gene expression of the mtDNA ATPase 6、ATPase 8 of the model rats decrease and Huangqi Jianzhong Decoction could protect and restore the gene expression ans has a better effect than that of Jinshuibao capsule group.

【Key words】COPD，HuangqiJianzhong Decoction，mtDNA ATPase 6 and Pase 8

慢性阻塞性肺疾病（COPD）近年来发病率呈明显上升趋势，是世界范围内重要的致残、致死原因。COPD患者普遍存在免疫力低下、营养不良、呼吸肌疲劳等问题，单独的营养支持并不能有效遏制病情的进展。COPD稳定期主要以巩固防复发，提高人体正气以防外邪为目的，临床发挥中医固本治疗的特色，采用黄芪建中汤治疗COPD稳定期患者疗效显著，且优于补益肺肾法。本课题以COPD模型大鼠为研究对象，观察COPD大鼠mtDNA ATPase6、8基因表达的改变，从基因与转录水平来探讨建中补虚法治疗COPD的作用机制。

1研究方法

1.1实验动物健康雄性SD大鼠，体重（250±10）g，共120只，由安徽省实验动物中心提供（动物合格证号：scxk（皖）2011-002）。动物自由饮水和摄食，温度20℃～23℃，相对湿度70%，适应性喂养1周。endprint

1.2药物与试剂黄芪建中汤（黄芪5 g，白芍20 g，饴糖30 g，桂枝10 g，生姜9 g，炙甘草6 g，大枣6枚）购自安徽中医药大学第一附属医院中药房，常规煎法，并浓缩成相应浓度。金水宝胶囊由江西金水宝制药有限公司出品（批准文号：（89）卫药准字z-18号，批号：011101）；脂多糖/内毒素（美国Sigma公司，L-2880，10 mg/支）；罗丹明123（Rh123，为美国Sigma公司产品）；真龙牌香烟（广西中烟工业有限责任公司出品，焦油量12 mg，烟气烟碱量1.2 mg，烟气一氧化碳量13 mg）；Trizol Reagent（invitrogen公司，货号：15596-026）；逆转录试剂盒（Fermentas公司，货号：00064525）；PCR试剂和Taq DNA聚合酶（Fermentas公司 美国）；氯仿、无水乙醇、异丙醇（上海中试化学试剂有限公司）；DEPC（Sigma公司）；引物及探针合成（invitrogen公司）；荧光定量试剂（TaKaRa公司）。

1.3分组、模型制作及给药方法将动物随机分为6组：即A组（正常对照组）、B组（COPD模型组）、C组（黄芪建中汤组高剂量组）、D组（黄芪建中汤组中剂量组）、E组（黄芪建中汤组低剂量组）、F组（金水宝胶囊组），每组20只。按照宋一平等[1]介绍的方法（香烟雾熏加LPS气管滴入法）复制大鼠COPD模型，即制模开始后1 d和14 d向气管内滴入LPS各1 g/L，2～13 d和15～60 d每日在80 cm×50 cm×40 cm密闭箱内香烟雾熏30 min（烤烟型，焦油量12 mg，烟气烟碱量1.2 mg），每次10支。黄芪建中汤常规煎法，并浓缩成相应浓度。给药剂量分别为低剂量组2.8 g/kg/d，中剂量组5.6 g/kg/d，高剂量组11.2 g/kg/d（以上均为生药量），分别相当于临床用量的5、10、20倍，金水宝胶囊组给药剂量为0.5 g/kg/d，相当于临床用量的10倍，灌胃8周。

3讨论

目前，从脾论治COPD的研究较为活跃，不仅有理论探讨、临床疗效观察，而且还涉及到作用机理方面的研究，机理研究方面已涉及到抗炎性介质、抗氧化、细胞免疫调节以及病理学的改变等内容。但综观目前的研究现状，指标的相关性不够明确，特异性不强，因此中医作用机制及靶点所在尚不明确。众所周知，线粒体是整个细胞乃至生命体进行各项生命功能活动的枢纽和核心，线粒体作为氧化磷酸化场所，主要功能是合成和利用ATP，为细胞生命活动提供能量。催化此能量偶联反应的酶为F0F1-ATPase，它位于线粒体内膜的基质侧，主要由F0和F1组成。ATPase 6、ATPase 8是F0F1-ATPase疏水部分F0的两个亚基，由mtDNA ATPase6、ATPase8基因编码。F0部分是镶嵌在线粒体内膜的质子通道，当H+顺浓度梯度经F0回流时F1催化ADP和Pi生成并释放ATP[2]。ATPase6亚基在线粒体电子转递链的氧化磷酸化过程中起质子泵作用，而ATPase8亚基主要与ATP合成酶活性有关[3～4]。

本实验中模型组大鼠mtDNA ATPase 6、ATPase 8荧光表达水平明显下降，说明ATP酶合成减少，线粒体能量代谢障碍；而治疗组相较于模型组荧光表达水平明显升高，说明黄芪建中汤具有对抗内毒素和烟雾造成的ATPase 6、ATPase 8基因表达下调，提高ATPase活性，改善细胞能量供应而发挥其保护效应。

参考文献：

[1]中华医学会呼吸病学分会·慢性阻塞性肺疾病诊治指南[J]·中华结核和呼吸杂志，2002，25：453-460.

[2]Ronnemaa T，KnipM，Lautala P，et al.Serum insulin and other cardio 2 vascular risk indicators in children，adolescents and young adults[J].AnnMed，199，l 23（1）：67-72.

[3]MustA，DallalGE，DietzWH.Reference data for obesity：85th and 95th percentiles of body mass index（wt/ht2）and triceps skinfold thickness[J].Am JClinNutr，1991，53（4）：839-846.

[4]BellizziMC，DietzWH.Workshop on childhood obesity：Summary of the discussion[J].Am JClinNutr，1999，70（1）：173-175.

（收稿日期：2014-03-07）endprint

1.2药物与试剂黄芪建中汤（黄芪5 g，白芍20 g，饴糖30 g，桂枝10 g，生姜9 g，炙甘草6 g，大枣6枚）购自安徽中医药大学第一附属医院中药房，常规煎法，并浓缩成相应浓度。金水宝胶囊由江西金水宝制药有限公司出品（批准文号：（89）卫药准字z-18号，批号：011101）；脂多糖/内毒素（美国Sigma公司，L-2880，10 mg/支）；罗丹明123（Rh123，为美国Sigma公司产品）；真龙牌香烟（广西中烟工业有限责任公司出品，焦油量12 mg，烟气烟碱量1.2 mg，烟气一氧化碳量13 mg）；Trizol Reagent（invitrogen公司，货号：15596-026）；逆转录试剂盒（Fermentas公司，货号：00064525）；PCR试剂和Taq DNA聚合酶（Fermentas公司 美国）；氯仿、无水乙醇、异丙醇（上海中试化学试剂有限公司）；DEPC（Sigma公司）；引物及探针合成（invitrogen公司）；荧光定量试剂（TaKaRa公司）。

1.3分组、模型制作及给药方法将动物随机分为6组：即A组（正常对照组）、B组（COPD模型组）、C组（黄芪建中汤组高剂量组）、D组（黄芪建中汤组中剂量组）、E组（黄芪建中汤组低剂量组）、F组（金水宝胶囊组），每组20只。按照宋一平等[1]介绍的方法（香烟雾熏加LPS气管滴入法）复制大鼠COPD模型，即制模开始后1 d和14 d向气管内滴入LPS各1 g/L，2～13 d和15～60 d每日在80 cm×50 cm×40 cm密闭箱内香烟雾熏30 min（烤烟型，焦油量12 mg，烟气烟碱量1.2 mg），每次10支。黄芪建中汤常规煎法，并浓缩成相应浓度。给药剂量分别为低剂量组2.8 g/kg/d，中剂量组5.6 g/kg/d，高剂量组11.2 g/kg/d（以上均为生药量），分别相当于临床用量的5、10、20倍，金水宝胶囊组给药剂量为0.5 g/kg/d，相当于临床用量的10倍，灌胃8周。

3讨论

目前，从脾论治COPD的研究较为活跃，不仅有理论探讨、临床疗效观察，而且还涉及到作用机理方面的研究，机理研究方面已涉及到抗炎性介质、抗氧化、细胞免疫调节以及病理学的改变等内容。但综观目前的研究现状，指标的相关性不够明确，特异性不强，因此中医作用机制及靶点所在尚不明确。众所周知，线粒体是整个细胞乃至生命体进行各项生命功能活动的枢纽和核心，线粒体作为氧化磷酸化场所，主要功能是合成和利用ATP，为细胞生命活动提供能量。催化此能量偶联反应的酶为F0F1-ATPase，它位于线粒体内膜的基质侧，主要由F0和F1组成。ATPase 6、ATPase 8是F0F1-ATPase疏水部分F0的两个亚基，由mtDNA ATPase6、ATPase8基因编码。F0部分是镶嵌在线粒体内膜的质子通道，当H+顺浓度梯度经F0回流时F1催化ADP和Pi生成并释放ATP[2]。ATPase6亚基在线粒体电子转递链的氧化磷酸化过程中起质子泵作用，而ATPase8亚基主要与ATP合成酶活性有关[3～4]。

本实验中模型组大鼠mtDNA ATPase 6、ATPase 8荧光表达水平明显下降，说明ATP酶合成减少，线粒体能量代谢障碍；而治疗组相较于模型组荧光表达水平明显升高，说明黄芪建中汤具有对抗内毒素和烟雾造成的ATPase 6、ATPase 8基因表达下调，提高ATPase活性，改善细胞能量供应而发挥其保护效应。

参考文献：

[1]中华医学会呼吸病学分会·慢性阻塞性肺疾病诊治指南[J]·中华结核和呼吸杂志，2002，25：453-460.

[2]Ronnemaa T，KnipM，Lautala P，et al.Serum insulin and other cardio 2 vascular risk indicators in children，adolescents and young adults[J].AnnMed，199，l 23（1）：67-72.

[3]MustA，DallalGE，DietzWH.Reference data for obesity：85th and 95th percentiles of body mass index（wt/ht2）and triceps skinfold thickness[J].Am JClinNutr，1991，53（4）：839-846.

[4]BellizziMC，DietzWH.Workshop on childhood obesity：Summary of the discussion[J].Am JClinNutr，1999，70（1）：173-175.

（收稿日期：2014-03-07）endprint

1.2药物与试剂黄芪建中汤（黄芪5 g，白芍20 g，饴糖30 g，桂枝10 g，生姜9 g，炙甘草6 g，大枣6枚）购自安徽中医药大学第一附属医院中药房，常规煎法，并浓缩成相应浓度。金水宝胶囊由江西金水宝制药有限公司出品（批准文号：（89）卫药准字z-18号，批号：011101）；脂多糖/内毒素（美国Sigma公司，L-2880，10 mg/支）；罗丹明123（Rh123，为美国Sigma公司产品）；真龙牌香烟（广西中烟工业有限责任公司出品，焦油量12 mg，烟气烟碱量1.2 mg，烟气一氧化碳量13 mg）；Trizol Reagent（invitrogen公司，货号：15596-026）；逆转录试剂盒（Fermentas公司，货号：00064525）；PCR试剂和Taq DNA聚合酶（Fermentas公司 美国）；氯仿、无水乙醇、异丙醇（上海中试化学试剂有限公司）；DEPC（Sigma公司）；引物及探针合成（invitrogen公司）；荧光定量试剂（TaKaRa公司）。

1.3分组、模型制作及给药方法将动物随机分为6组：即A组（正常对照组）、B组（COPD模型组）、C组（黄芪建中汤组高剂量组）、D组（黄芪建中汤组中剂量组）、E组（黄芪建中汤组低剂量组）、F组（金水宝胶囊组），每组20只。按照宋一平等[1]介绍的方法（香烟雾熏加LPS气管滴入法）复制大鼠COPD模型，即制模开始后1 d和14 d向气管内滴入LPS各1 g/L，2～13 d和15～60 d每日在80 cm×50 cm×40 cm密闭箱内香烟雾熏30 min（烤烟型，焦油量12 mg，烟气烟碱量1.2 mg），每次10支。黄芪建中汤常规煎法，并浓缩成相应浓度。给药剂量分别为低剂量组2.8 g/kg/d，中剂量组5.6 g/kg/d，高剂量组11.2 g/kg/d（以上均为生药量），分别相当于临床用量的5、10、20倍，金水宝胶囊组给药剂量为0.5 g/kg/d，相当于临床用量的10倍，灌胃8周。

3讨论

目前，从脾论治COPD的研究较为活跃，不仅有理论探讨、临床疗效观察，而且还涉及到作用机理方面的研究，机理研究方面已涉及到抗炎性介质、抗氧化、细胞免疫调节以及病理学的改变等内容。但综观目前的研究现状，指标的相关性不够明确，特异性不强，因此中医作用机制及靶点所在尚不明确。众所周知，线粒体是整个细胞乃至生命体进行各项生命功能活动的枢纽和核心，线粒体作为氧化磷酸化场所，主要功能是合成和利用ATP，为细胞生命活动提供能量。催化此能量偶联反应的酶为F0F1-ATPase，它位于线粒体内膜的基质侧，主要由F0和F1组成。ATPase 6、ATPase 8是F0F1-ATPase疏水部分F0的两个亚基，由mtDNA ATPase6、ATPase8基因编码。F0部分是镶嵌在线粒体内膜的质子通道，当H+顺浓度梯度经F0回流时F1催化ADP和Pi生成并释放ATP[2]。ATPase6亚基在线粒体电子转递链的氧化磷酸化过程中起质子泵作用，而ATPase8亚基主要与ATP合成酶活性有关[3～4]。

本实验中模型组大鼠mtDNA ATPase 6、ATPase 8荧光表达水平明显下降，说明ATP酶合成减少，线粒体能量代谢障碍；而治疗组相较于模型组荧光表达水平明显升高，说明黄芪建中汤具有对抗内毒素和烟雾造成的ATPase 6、ATPase 8基因表达下调，提高ATPase活性，改善细胞能量供应而发挥其保护效应。

参考文献：

[1]中华医学会呼吸病学分会·慢性阻塞性肺疾病诊治指南[J]·中华结核和呼吸杂志，2002，25：453-460.

[2]Ronnemaa T，KnipM，Lautala P，et al.Serum insulin and other cardio 2 vascular risk indicators in children，adolescents and young adults[J].AnnMed，199，l 23（1）：67-72.

[3]MustA，DallalGE，DietzWH.Reference data for obesity：85th and 95th percentiles of body mass index（wt/ht2）and triceps skinfold thickness[J].Am JClinNutr，1991，53（4）：839-846.

[4]BellizziMC，DietzWH.Workshop on childhood obesity：Summary of the discussion[J].Am JClinNutr，1999，70（1）：173-175.

（收稿日期：2014-03-07）endprint