人C型溶菌酶发酵与分离纯化工艺的研究

王林涛 姚笛

摘要 [目的]研究毕赤酵母菌株（Pichia GS115）表达人C型溶菌酶（HLYZ）的发酵与分离纯化的工艺。[方法]探讨酵母生长规律，研究不同菌体浓度、不同诱导时间对蛋白产量的影响，并且探讨不同pH条件对DEAESepharose FF和CMSepharose FF层析分离纯化目标蛋白的影响。[结果] 毕赤酵母菌株表达HLYZ的最佳发酵条件为：发酵24 h用浓度1%甲醇诱导，以后每12 h用浓度1%甲醇诱导，共6次，在此条件下可获得高产量目标蛋白。DEAESepharose FF和CMSepharose FF分离纯化目标蛋白的最佳pH 分别为6.65和6.50。[结论]该研究可为人C型溶菌酶的工艺化生产提供理论指导。

关键词 人C型溶菌酶；毕赤酵母；发酵；DEAE与CM层析

中图分类号 S188+.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）31-10836-03

Study of the Human Ctype Lysozyme Fermentation， Separation and Purification

WANG Lintao1， YAO Di2

（1. School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200433； 2. Changzhou Technican College， Changzhou， Jiangsu 213017）

Abstract [Objective] To study the fermentation， separation and purification of human ctype lysozyme from Pichia yeast strain （Pichia GS115）. [Method] The effections of different cell concentration and different induction time on the protein production were investigated. The effection of the pH conditions on the DEAESepharose FF and CMSepharose FF chromatography separation and purification of the target protein were also investigated. [Result] It was found that optimal fermentation conditions for human ctype lysozyme were as follows： induction with 1% methanol after 24 h fermentation， next， induction with 1% methanol every 12 h， six times. Under the above conditions， high yield of the target proteins were obtained. The optimal pH conditions for the DEAESepharose FF and CMSepharose FF separation and purification are 6.65 and 6.5. [Conclusion] The research provides theoretical guidance for the industrial production of human ctype lysozyme from Pichia yeast strain （Pichia GS115）.

Key words Human ctype lysozyme； Pichia yeast； Fermentation； DEAESepharose FF and CMSepharose FF

C型人溶菌酶（HLYZ）由英國著名科学家弗莱明^[1]发现，是一种1，4βN溶菌酶。它切割细菌细胞壁肽聚糖N乙酰胞壁酸（MurNAc）和N乙酰葡萄糖胺（GlcNAcC4）之间的糖苷键，破坏肽聚糖骨架，在细菌内部渗透压作用下导致细菌破裂达到杀菌效果^[2]。HLYZ广泛存在于人体的体液、细胞及组织器官中^[3]，可见其对人体的重要性。HLYZ有着独特的优越性和非常多的药理作用，具有多重临床应用价值^[4-8]。鉴于其重要的生理作用，目前国外对HLYZ的制备过程进行了广泛的研究与开发，所采用的HLYZ表达的宿主菌大多为毕赤酵母GS115菌株，以pPIC9K为载体，可以获得对HLYZ的高表达^[9]。

国内采用毕赤酵母发酵生产HLYZ的报道较少，有利用大肠杆茵、酵母茵和真茵表达系统表达HLYZ，最高水平为40 mg/L^[10]。笔者采用毕赤酵母GS115菌株表达HLYZ，分别研究不同菌体浓度、不同诱导时间对蛋白产量的影响，得出可获得高产量HLYZ的发酵条件。近年来，有利用离子交换层析分离纯化人溶菌酶研究的报道^[11-12]。笔者在不同pH条件下对HLYZ进行DEAESepharose FF及CMSepharose FF层析分离纯化研究。在SDSPAGE电泳检测结果，清晰可见单一目标蛋白条带，分离纯化效果非常好。该研究为实现HLYZ规模化生产提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。含pPIC9K/HLYZ载体的毕赤酵母菌GS115HLYZ重组菌株，由研究室构建和保存；HLYZ活性测定用溶壁微球菌AS 1.634，购自中国科学院微生物研究所。

1.1.2 培养基。斜面培养基为YPDG418培养基，组成为：蛋白胨2%，酵母提取物1%，葡萄糖2%，琼脂2%；摇瓶和发酵培养基为BMGY培养基，组成为：蛋白胨2%，酵母提取物1%，磷酸缓冲液0.1mol/L（pH 6.0），酵母氮源培养基（YNB）1.34%，生物素0.4 mg/L，甘油2%。

1.1.3 层析剂。DEAESepharose FF，CMSepharose FF，购自GE Healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1 摇瓶培养。

从-70 ℃冷冻冰箱取出冷冻菌液，接种于YPDG418斜面上培养24 h，接一级种于120 ℃、20 min灭菌的装量为500 ml BMGY培养基的2 000 ml三角摇瓶中，30 ℃，200 r/min摇床培养16 h。

1.2.2 发酵及诱导表达。将500 ml摇瓶种子接种到120 ℃，20 min灭菌的装量10 L BMGY培养基的15 L发酵罐中发酵，发酵温度30 ℃，pH用浓度12%氨水、2 mol/L盐酸控制在5.5，溶解氧（DO）控制在10%～15%相对饱和浓度，细胞生长36 h或24 h后加浓度1%甲醇诱导表达HLYZ蛋白，其后定时多次加浓度1%甲醇诱导。

1.2.3 分析方法。

1.2.3.1 菌体量的测定。以纯水为对照，发酵液稀释后在波长600 nm处比色，测定吸光度。

1.2.3.2 HLYZ活性的测定。将摇瓶培养的溶壁微球菌悬混于0.1 mol/L PBS中，配制成光密度为1.0（可见光分光光度计测定，λ530）浓度的菌体溶液。取毕赤酵母发酵液离心上清液0.75 ml于装有3 ml已配制的恒温30 ℃的溶壁微球菌的比色皿中，立即摇匀，记录可见光分光光度计（λ430）1 min的光密度数变化。酶活单位为光密度每下降0.001即为一个酶活单位。

1.2.3.3 分离纯化HLYZ得率的计算。分离、纯化后得到的收集液HLYZ活性总量与分离前样品HLYZ活性总量之比。

1.2.3.4 目标蛋白分子量的测定。采用SDSPAGE电泳，测定分离纯化溶液过程中目标蛋白。

1.2.4 发酵液预处理。

发酵结束后立即4 ℃，4 000 r/min离心分离菌体，取上清液于-18 ℃冰箱保存。

1.2.5 DEAE sepharose层析分离纯化。DEAESepharose FF粉状颗粒经0.1 mol/L PBS（pH 7.5）溶液平衡2 h，装柱（10 mm×220 mm），在BioRad常压层析仪上层析，10 ml发酵液上柱，速度1 ml/min，收集流出液，在λ280处测定出峰的流出液HLYZ活性，合并活性收集液。

1.2.6 CMSepharose FF层析分离纯化。

CMSepharose FF粉状颗粒经0.1 mol/L PBS（pH 7.5）溶液平衡2 h，装柱（10 mm×220 mm），在BioRad常壓层析仪上层析，20 ml DEAESepharose FF收集液上柱，速度1 ml/min，用pH 7.5 PBS冲洗，直至冲完所有出峰，不收集；用2 mol/L NaCl的pH 7.5 PBS洗脱柱，收集第2个出峰。在λ280处测定第2个出峰的流出液HLYZ活性，合并活性收集液。

2 结果与分析

2.1 发酵条件及HLYZ产量

2.1.1 菌体浓度对HLYZ产量的影响。

BMGY培养基发酵，菌体培养36 h后每24 h加浓度1%甲醇诱导，测定菌体浓度和HLYZ活性。BMGY培养基中碳氮比不合适，使得菌体浓度生长受到限制。在BMGY基础上流加甘油，直至菌体生长到最大浓度，在较高菌体浓度下诱导HLYZ表达。从图1和图2可以看出，在菌体浓度A600达到32时比A600 达到15时HLYZ活性高出1.8倍。因此，在发酵菌体高浓度下HLYZ产量增加。

2.1.2 诱导时间对HLYZ产量的影响。

HLYZ活性在诱导12 h后不再增加，甚至活性出现下降。这可能是HLYZ被蛋白酶分解的原因。因此，在菌体生长24 h达到最高浓度后开始诱导，每12 h诱导1次，直至诱导后HLYZ活性不再增加。从图3可以看出，在对甲醇诱导时间缩短至12 h以及增加诱导次数的情况下，HLYZ产量大大提高，在同等菌体浓度下发酵产量提高1.6倍。

2.2 HLYZ分离纯化

2.2.1 DEAESepharose FF分离纯化。

离子交换层析分离蛋白质离子时pH对分离效果、得率有很大的影响。在不同pH下对发酵液进行蛋白层析分离。

从表1可以看出，在其他条件不变的情况下，随着pH的提高，HLYZ活性先上升，在pH 6.65左右达到较高值，此时目标蛋白得率最高。蛋白质分离效果见图4。

2.2.2 CMSepharose FF分离纯化。

从表2可以看出，在其他条件不变的情况下，随着pH的提高，HLYZ活性先上升，在pH6.5左右达到较高值，此时目标蛋白得率最高。图5显示蛋白分离效果。CM分离纯化后SDSPAGE凝胶电泳实验检测见图6。

3 结论与讨论

通过不同菌体浓度、甲醇诱导时间2个因素对HLYZ发

酵条件进行优化，发现在发酵菌体高浓度下HLYZ产量增加。在将甲醇诱导时间缩短至12 h以及增加诱导次数的情况下，HLYZ产量大大提高，在同等菌体浓度下发酵产量提高1.6倍。在发酵过程中影响HLYZ产量的因素还有很多，如碳源、氮源浓度、pH、温度等。该研究仅对菌体浓度及甲醇诱导时间2个因素加以分析，因此想要规模化生产HLYZ，还有待进一步分析。

利用DEAESepharose FF和CMSepharose FF在不同pH下对HLYZ进行分离纯化。研究表明，在 pH 6.65下DEAESepharose FF和pH 6.5下CMSepharose FF对目标蛋白分离纯化得率最高；DEAESepharose FF分离纯化杂峰较多，进一步进行CMSepharose FF层析仅一个杂峰。经DEAE和CM分离纯化后，通过SDSPAGE凝胶电泳实验检测，发现在14.6 kDa处有一条清晰可见的单一条带，几乎没有其他杂带，说明分离效果非常好，最后经过冷冻干燥得到蛋白冻干粉，其比活可以达到52 000 U/mg。

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