间充质干细胞增殖的研究进展

史恒瑞 董平

【摘要】间充质干细胞属于多潜能干细胞，其多向分化的能力在临床治疗中有广泛的应用价值。但通过目前的研究发现，间充质干细胞在增殖过程中存在着随着体外培养时间增加增殖潜力和多向分化潜力逐渐丧失的问题。因此，如何使间充质干细胞在体外培养时可以稳定地增殖逐渐成为研究的热点。下面从目前常见的几种间充质干细胞增殖的方法就间充质干细胞增殖的研究进展作一综述。

【关键词】间充质干细胞 增殖

【中图分类号】R-1 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949(2014)07-0605-01

间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）是干细胞的一个分支，其来源于发育早期的中胚层和外胚层，系多潜能干细胞，其主要存在于结缔组织及器官间质中，尤以骨髓中含量最为丰富，在体内或体外特定的诱导条件下，可以分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，这种多向分化潜能和极强的可塑性使其在组织工程、基因治疗和免疫治疗方面有着巨大的应用前景。但人体内的间充质干细胞毕竟有限，且MSC在体外传代、增殖过程中存在着增殖能力和多向分化能力逐渐丧失的问题［6-9］，无法完全满足临床治疗的需要，所以，如何获得量大质优的间充质干细胞就成为其成功应用于临床治疗的瓶颈。本文就不同来源的间充质干细胞促增殖方法的角度就间充质干细胞增殖的研究进展做一综述。

1人羊膜间充质干细胞

人羊膜是来源于胎儿的胚胎早期产物，位于胎盘的最内层，厚约0.02-0.05毫米，其透明、韧性佳，无血管、神经和淋巴管等组织，组织结构分为上皮层、基底膜层、致密层、纤维母细胞层及海绵层，随孕妇分娩排出体外，是生产的废弃物。人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs）即存在于人羊膜中，具有获取相对简单、不增加额外创伤、几乎不受伦理学限制、来源丰富、免疫原性低、增殖能力强及多向分化潜能等优势［1］，有望成为组织工程中理想的种子细胞。但人羊膜间充质干细胞同样存在着缺陷，其在体外传代、增殖过程中会逐渐丧失其自我增殖能力及多向分化潜能。为此，张一折等［2］将β-catenin-綠色荧光蛋白重组腺病毒扩增后，转染人羊膜间充干细胞，在荧光倒置显微镜下观察转染效率并采用CCK-8法测定细胞的生长状况，结果发现β-catenin-绿色荧光蛋白在细胞中高表达，且由于β-catenin的高表达刺激了人羊膜间充质干细胞的增殖。此外，李彩虹等［3］将人羊膜间充质干细胞培养至第三代，经过不同浓度的表皮生长因子处理后采用MTT法测量细胞的存活率，通过计数穿过transwell小室的细胞数测定表皮生长因子对细胞迁徙能力的影响，并用表皮生长因子受体的抑制剂AG1478及P13K的抑制剂LY294002检测其对细胞迁徙能力的影响，结果发现表皮生长因子处理后的细胞增殖和迁徙能力均得到一定程度上的增加，为人羊膜间充质干细胞更好地治疗皮肤创伤及伤口愈合提供了实验依据。王兆福等［4］发现将两个个体来源的人羊膜间充质干细胞混合培养后增殖情况高于单独培养的细胞，但未做更深入的研究。陈亭等［5］将人羊膜间充质干细胞分别置于体积分数为5﹪02和20﹪02条件下培养并做成骨诱导，观察细胞在不同氧浓度下生长情况及成骨分化情况，得出结论：与常氧组相比，低氧更能促进人羊膜间充质干细胞的增殖及成骨分化.并大胆推测这可能是由于低氧情况下细胞产生的乳酸明显减少所导致的。周倩等［10］将人羊膜间充质干细胞分别在孔板静态及微载体动态培养条件下扩增及成骨诱导，发现在微载体动态诱导培养条件下可获得较高的细胞数和较好的成骨诱导分化效果，提高了碱性磷酸酶活性与钙基质含量，流体刺激与包被的I型胶原均可促进人羊膜间充质干细胞的成骨分化，且两者联合应用时促进作用更明显。因此，基于微载体的动态培养体系可以促进间充质干细胞在骨组织再生工程中的应用。

2骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem ceils，BMSCs)不仅具有干细胞多向分化潜能，还具有低免疫源性、易于获取等特点，并易于外源基因的转染和表达，因此，它已成为细胞治疗和基因治疗等领域中能有效发挥作用的理想工程细胞［11］。但是骨髓中BMSCs含量极其稀少，BMSCs在体外增殖亦较慢，而且随着传代次数的增加，细胞表型就会逐渐丧失［12-13］。因此，如何实现少量取样且大批量获取是BMSCs满足临床实验研究的当务之急。为此，刘红等［14］ 运用siRNA干扰技术沉默低氧诱导因子-1α 基因，将细胞分成6组，分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞仪和乳酸脱氢酶(1actic acid dehydrogenase，LDH)活力测定等方法，检测各组BMSCs的增殖、凋亡和坏死情况；Western blot和real-time PCR检测各组BMSCs中HIF-1α 、葡萄糖转运子-1(glucose transporter，GLUT-1)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的mRNA和蛋白的表达，得出结论：低氧预处理可促进BMSCs的体外增殖，减轻坏死，其机制可能与低氧预处理后HIF-1α 表达增加及上调其下游基因GLUT-1和VEGF表达有关。王立维等［15］通过研究得出了与上述实验相似的结论：大鼠骨髓间充质干细胞移植在低氧(体积分数1%O2)下增殖和迁移能力增强。另外，任立杰等［16］为寻求能在体外快速、大量的增殖骨髓间充质干细胞，采用了锌及碱性成纤维细胞生长因子单独或联合加入到培养基中，观察细胞生长状况，结果证实，锌和碱性成纤维因子均有促进体外培养的骨髓间充质干细胞增殖的作用，联合应用锌和碱性成纤维细胞生长因子促增殖作用最强，而且可以保持骨髓间充质干细胞的生物学活性，可以作为体外扩增培养骨髓，基质细胞的最佳培养条件。有研究表明［22］：改良富血小板血浆对人骨髓间充质干细胞增殖的促进作用具有浓度依赖性，且10%改良富血小板血浆可以较好地保持人骨髓间充质干细胞的免疫原性。随着中药学的发展，其独特的药理学作用也越来越受到人们的关注，王明宁等［17］利用香丹注射液促进了大鼠骨髓间充质干细胞的增殖，这个发现也为科研人员开辟了新的思路。继王明宁之后，陆续有报道称淫羊藿苷［18］、麝香酮［19］、独参汤［20］、复方接骨中药［21］均对骨髓间充质干细胞有促增值的作用。

3脐血间充质干细胞

脐血是婴儿出生后，留在胎盘和脐带中的血液，脐血中含有大量的造血干细胞，同时还含有丰富的造血基质细胞（基质细胞泛指间充质来源的非造血干细胞）。基质细胞是造血干细胞赖以生存的微环境，在造血调控中发挥重要的作用。脐血间充质干细胞即是其中的一种，它具有不同于造血干细胞的生物学特性。脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞相比，具有一些特殊的优势：脐血来源最广泛，对供者最安全。 采集脐血对产妇和新生儿均无任何不良影响。有研究表明［23］：脐血干细胞端粒和端粒酶活性均长于和高于骨髓中的干祖细胞,因此移植后的寿命更长，可以更持久地维持机能。Terai等［24］发现脐血干细胞通过转染携带人端粒酶逆转录酶的逆转录病毒以延长寿命。脐血间充质干细胞为较原始的间充质干细胞，具有更强的增殖、分化能力；而且细胞的未发育成熟，特别是免疫重建后T细胞的功能较弱，因此引起的移植物抗宿主病较弱［25］。尽管脐血间充质干细胞拥有如此多的优点，但在实验中发现：脐血间充质干细胞的分离培养成功率较低，如何提高脐血间充质干细胞的贴壁粘附及生长需要进一步的探索。杜江榕等［26］发现：在培养基中加入5-100ng/ml的表皮生长因子（EGF）对脐血间充质干细胞具有促增殖的效应，且作用强度呈剂量依赖性。另有报道［27］称：在培养基中添加0.15g/L的还原性谷胱苷肽可以明显促进脐血间充质干细胞的增殖，并且在增殖的同时不影响脐血间充质干细胞的表面标志分子CD29/CD44/CD45等，通过此法有望为复杂疾病的干细胞治疗提供足量的细胞。颜小华等［28］通过控制变量、分组培养后发现：黄岑苷体可有效促进人脐血单个核细胞的增殖，并推测可能与在一定程度上激活即刻早期基因核转录因子K+B，进而促使细胞提高分泌白细胞介素6水平有关。王哲等［29］报道：在每升培养基中加入10、20、50、100微摩尔普罗布考可促进细胞的增殖，降低细胞ROS含量，增加SOD和GSH-Px活性。

郑颖娟等［30］ 体外培养脐带间充质干细胞，经重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染，分组培养后，通过检测发现转染碱性成纤维细胞生长因子后细胞的生长速度明显增快，细胞周期G0/G1 期减少，S 期细胞数增多，说明通过重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染能促进体外培养的脐带间充质干细胞增殖，对其培养有优化作用。除在培养基中添加额外成份外，有学者则将研究重点放在了培养细胞的大环境上，据文献［31］报道：恒磁场对人脐血间充质干细胞增殖的影响与磁感应强度有关,0.05mT的磁场促进间充质干细胞的增殖，0.1mT的磁场对间充质干细胞无明显影响，0.5mT和1.0mT的磁场抑制间充质干细胞的增殖,但促进增殖的内在机制并未深入研究。

综上所述，目前国内外大量对于促进间充质干细胞体外大量增殖的研究，但对于采用何种方法存在不小的争议，大量的研究结果也没有系统的阐述促进间充质干细胞增殖的内在机制。因此，明确间充质干细胞增殖的内在机制并建立一套标准化的培养体系来实现间充质干细胞的大量增殖显得十分必要。

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