TGF-β1受体抑制剂LY2109761对成纤维细胞中PPARγ表达的影响

作者简介：姓名：朱美抒性别：女出生年月：1979年4月职位：主治医生 【摘要】目的 利用转化生长因子β1(transforming growth factor,TGFβ1)受体抑制剂LY2109761作用于成纤维细胞，观察其对细胞核内过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）表达的影响，探讨其潜在的抗衰老作用。方法 体外培养人成纤维细胞，利用MTT法筛选适宜浓度的LY2109761作用于成纤维细胞，用Western-blot、RT-PCR检测对PPARγ表达的影响。结果 TGF-β受体抑制剂LY2109761能显著增加PPARγ的表达，并呈剂量依赖效应。与对照组相比，LY2109761处理组PPARγ的表达量明显增多(p<0.01)；且LY2109761处理组的PPARγ基因的表达量显著增加(p<0.01)。结论 TGFβ1受体抑制剂LY2109761可诱导PPARγ的表达增多，具有一定潜在的抗衰老作用。

【关键词】 过氧化物酶体增殖物激活受体γ 转化生长因子β 成纤维细胞

【中图分类号】R619 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949(2014)07-0121-02

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisorne proliferator-activated receptorγ,PPARγ)系一类可以被过氧化物酶体增殖剂激活的核转录因子超家族，参与机体的多种病理生理功能的调控，如糖尿病、炎症反应、细胞周期等［1-4］。近年来研究发现，PPARγ随着年龄的增加，表达量减少［5］。PPARγ具有一定的潜在抗衰老的作用。而激活TGFβ1信号通路能引起成纤维细胞出现一系列衰老表型，而其下游机制作用因子尚不明确。本课题组前期研究证实TGF-β1和PPARγ存在负相关关系，由此我们提出TGF-β1-PPARγ调控轴的概念。本研究旨在观察TGFβ1受体抑制剂LY2109761对PPARγ表达的影响，近一步分析 TGFβ1对PPARγ的调控。

1材料与方法

1.1材料 成纤维细胞购于中科院典型培养物保藏委员会细胞库。胎牛血清和高糖DMEM培养基购自Gibco公司，LY2109761购自selleck公司。Trizol、Real-time PCR试剂盒、SYBR购于TAKARA公司，引物购美国Invitrogen公司。TGFβ1和PPARγ抗体均购自Santa Cruz公司，蛋白浓度检测试剂盒购于Bio-Rad公司，全细胞裂解试剂盒购于凯基公司。

1.2细胞株培养 将成纤维细胞株接种于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基（加青霉素10U/ml和链霉素100U/ml），置于5%CO2、37培养箱，培养细胞至融合约为80%时出传代，待细胞处于指数生长期是进行实验。

1.3 方法

1.3.1 细胞增殖测定：MTT法测定。胰酶消化细胞制成细胞悬液，并调整至1.5X104/ml，每孔100μl接种于96孔板，24h后分别加入终浓度为0、0.1μM/L、0.5μM/L、1μM/L、5μM/L、10μM/L的LY2109761每组重复6孔，然后分别培养24h、48h、72h后测定OD值。

1.3.2 Western-Blot检测相关蛋白：全细胞裂解液裂解细胞，提取蛋白，Lowery法测定蛋白浓度。加上样buffer煮蛋白。然后依次跑胶、转膜、封闭、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜、显影操作。以β-激动蛋白（β-actin）做内参。

1.3.3 RT-PCRRT-PCR提取总RNA按照相关试剂说明书进行，本实验采用10μl体系进行反转录，Real-time PCR按照说明书使用20μl体系。相对表达量用 2 –△△Ct法计算，β-actin做内参。。

1.3.4 数据统计分析：数据均采用均数±标准差表示。使用spss17.0统计软件分析，采用分析包括t检验和方差分析。

2 结果

2.1 细胞毒性实验(MTT)：不同浓度的LY2109761处理成纤维细胞，随着LY2109761浓度的增加，细胞活力降低。在药物浓度达到5μM/L时，与对照组相比有统计学意义(p<0.05)，结果见图1。

图1 MTT实验结果

2.2LY2109761 5μM/L处理细胞后PPARγ蛋白表达量及mRNA水平变化趋势相同。成纤维细胞经LY2109761处理后，PPARγ蛋白增多，mRNA转录增多。差异有统计学意义(p<0.05)。结果见图2。

B

图2A：对照组成纤维细胞与5μM/L的LY2109761处理组中PPARγ表达量。

B：对照组成纤维细胞与5μM/L的LY2109761处理组中PPARγ的mRNA相对表达量。注：与对照组比较* p<0.05

3 讨论

成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来，它对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用［6］。最新研究表明成纤维细胞可以降低年龄老化对皮肤的影响。

近年来一些新的研究发现，PPARγ随着年龄的增加，表达量减少［5］，PPARγ具有一定的潜在抗衰老的作用。TGFβ1的激活能引起一系列的衰老表型。本研究通过TGFβ1受体抑制剂，抑制TGFβ1的功能后发现，PPARγ表达增多，且基因水平和蛋白水平表达均增多，即抑制TGFβ1信号通路的能够增加PPARγ的表达量。TGFβ1受体抑制剂能够增加PPARγ的表达，具有一定潜在的抗衰老作用。

参考文献

［1］Simonin MA, Bordji K,Boyault S,etal.PPAR-γ ligands modulate effects of LPS in stimulated rat synovial fibroblasts［J］.Physiol Cell Physiol, 2002, 228:125-133.

［2］Janabi N.Selective inhibition of cyclooxygenase-2 expression by 15-deoxy-12,14-prostaglandinJ2inactivatedhuman astrocytes［J］.Immnun,2002,168:4747-4755．

［3］Hinz B, Brune Pahl A, etal.15d-PGJ2 inhibits the expression of proinflammatory genes in human blood monocytes via a PPAR-y independent mechanism ［J］.Biochem Biopsys Res Commun, 2003, 302:4l5-435.

［4］Desvergne B, Wahli W.Peroxisome proliferator-activated receptors: Nuclear control of metabolism. Peroxisome pmliferator-activated Receptors: nuclear control of metabolism ［J］.Endocr Rev, 1999, 20(5):649 – 688

［5］張秀锦,叶平,王兆君.老年大鼠PPARγ的表达及与胰岛素抵抗的关系［J］.中华老年医学杂志,2004;23(2):106-108.

［6］王英慧.成纤维细胞的生物学特性及其成骨作用的研究进展［J］.大同医学专科学校学报,2006,2:30-31.