胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞AMPKPPARγ的表达及意义*

吴乃君 刘颖 金秀平 陈晶 马绍杰 盛佳曦 魏剑芬

【摘要】 目的 观察胰岛素抵抗的的水平变化，探讨胰岛素抵抗脂肪细胞的分子机制。方法 体外培养前脂肪细胞, 并诱导其分化成熟,地塞米松诱导成熟脂肪细胞形成胰島素抵抗，利用RT-PCR 技术检测和葡萄糖转运子4表达变化。结果 地塞米松作用于3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量明显降低, 地塞米松诱导的胰岛素抵抗状态下AMPK、PPARγ和GLUT4 mRNA表达水平显著下调。结论 地塞米松降低3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量产生胰岛素抵抗，提示其表达水平下降可能是3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗原因之一。

【关键词】地塞米松;3T3-L1脂肪细胞;胰岛素抵抗;腺苷酸活化蛋白激酶;过氧化物酶增殖受体γ;葡萄糖转运子4

【Abstract】Objective To observe the changes of insulin resistance level, to investigate the molecular mechanism of insulin resistance adipocytes. Cultured preadipocytes in vitro, and induce its differentiation induced by dexamethasone in mature adipocytes,insulin resistance, change 4 expression was measured by RT-PCR technique and glucose transporter. Results dexamethasone effects on glucose consumption of 3T3-L1 cells decreased significantly, state AMPK, PPAR γ and GLUT4 mRNA expression was significantly lower in the dexamethasone induced insulin resistance. Conclusion dexamethasone reduced glucose consumption of 3T3-L1 fatty cells produce insulin resistance, suggesting that the gene expression level decreased may be one reason of insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes

【key words 】dexamethasone; 3 t3 - L1 fat cells; Insulin resistance; Amp activated protein kinase; Receptor gamma peroxidase proliferation; The glucose transporter

【中图分类号】R587.1 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949(2014)07-0027-01

*基金资助：河北省科技厅《二甲双胍对同型半胱氨酸及脂源性激素的影响研究》资助，课题编号122777104；唐山市科技局《二甲双胍对同型半胱氨酸的影响研究》资助，课题编号13130266Z。

肥胖、胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的病生理基础。肥胖是外部表象，内在根源在于脂肪细胞体积、数量的变化及糖、脂代谢紊乱。本研究选取3T3-L1前脂肪细胞为实验对象, 采用地塞米松诱导建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型，观察地塞米松对3T3-L1脂肪细胞的糖代谢 影响，从分子水平探讨3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的分子机制。

1材料与方法

1.1实验材料

3T3-L1前脂肪细胞株由天津血液病研究所惠赠。二甲基亚枫、地塞米松、IBMX、油红O均购自美国Sigma公司；胰岛素购自丹麦Novo Nordisk公司、DMEM 培养基购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司；葡萄糖测定试剂盒-氧化酶法购自盛科博源公司；荧光定量PCR试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2实验方法

1.2.1体外扩增、培养

大鼠前脂肪细胞（3T3-L1），培养基采用含15% 胎牛血清的DMEM培养液，T25塑料培养瓶在37℃，5%CO2的孵育箱内，培养方法为贴壁法，当80%-90%细胞融合时，进行传代培养，加入完全DMEM培养液，吹打混匀，48小时换液一次。

1.2.2诱导、分化、油红O染色证实成熟脂肪细胞

取3代细胞，对3T3-L1前脂肪细胞株进行诱导分化。8-12天后显微镜下观察可见80％-90％3T3-L1细胞呈成熟脂肪细胞表型。

1.2.3 地塞米松作用在成熟的3T3-L1脂肪细胞，建立胰岛素抵抗细胞模型

把分化好的细胞按实验设计分空白组和模型组, 模型组加入1umo l/L 地塞米松建立胰岛素抵抗, 48小时换液一次, 分别在48小时，96小时取上清液, 用葡萄糖检测试剂盒测定培养基中葡萄糖含量，胰岛素抵抗的程度以培养基中葡萄糖消耗量反映。

1.2.4胰岛素抵抗状态下的3T3-L1脂肪细胞AMPK、PPARγ、和GLUT4 mRNA水平测定

在96孔板中, 将诱导分化成熟的3T3-Ll 脂肪细胞分为空白组、模型组，空白组加入等体积细胞培养液。模型组每孔加1μmol/L地塞米松诱导胰岛素抵抗，共同孵育96小时，当细胞胰岛素抵抗达最佳状态时取上清液，检测培养基中葡萄糖含量（采用葡萄糖试剂盒检测GOD一POD法)，提取RNA，采用荧光定量PCR试剂盒监测AMPK、PPARγ、和GLUT4 mRNA。

AMPKα引物:

上游：5—CCTTTACCACGGTTGATTTCTC—3

下游：5—CAGGCTCTACTTTGATCGCACT—3

PPARr引物：

上游：5—GTACTGTCGGTTTCAGAAGTGCC—3

下游：5—TCCGCCAACAGCTTCTCCT—3

GLUT4引物：

上游：5—TCTCGGTGCTCTTAGTAG—3

下游：5—CCAATCTCAAAGAAGGCCACAAA—3

GAPDH引物：

上游：5—GGTGAAGGTCGGTGTGAACG—3

下游：5—GCTCCTGGAAGATGGTGATGG—3

1.3统计学方法

所有数据采用SPSS13.0软件包进行统计分析，计量资料以均数士标准差（ X±s）表示，组间差异用t检验，P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 3T3-L1脂肪细胞形态的观察：

未诱导分化的3T3-L1前脂肪细胞呈为梭形成纤维细胞，胞浆内没有脂滴，胞核清晰。在诱导分化的第5天，镜下可见细胞形态变圆、体积增大，细胞内在细胞核周围可见少量脂肪小滴。第10-12天呈成熟的脂肪细胞形态，在细胞核周围有大量圆形脂肪滴聚集，细胞更圆更亮，油红O染色后胞浆内脂滴呈红色，胞核呈蓝色，证实为成熟脂肪细胞。

2.2培养基上清葡萄糖测定

3T3-L1脂肪细胞诱导分化成熟后，给予地塞米松作用，分别测48h，96h空白组及模型组细胞培养上清葡萄糖浓度，空白组48h葡萄糖OD值1.4798±0.0026，96小时葡萄糖OD值1.4755±0.003，模型组48h葡萄糖OD值2.2218±0.0437，96小时葡萄糖OD值2.5342±0.0076，模型组葡萄糖浓度高于空白组（P<0.05），模型组葡萄糖浓度96h高于48小时（P<0.05），可见96h胰岛素抵抗达最佳。

3讨论

糖尿病发病率逐年上升，肥胖及胰岛素抵抗是糖尿病发病中心环节。由于取材、生存能力差等因素，目前脂肪细胞研究多采用3T3-L1脂肪细胞，本实验参考AnilKumar ［1］的方法，对3T3-L1前脂肪细胞株进行诱导分化。实验结果显示，地塞米松降低了3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖糖转运，推测其可能通过抑制脂肪细胞的葡萄糖摄取降低胰岛素敏感性，诱导3T3-L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗，这与国内文献报道相近［1］。从培养基中转运葡萄糖入细胞的量降低, 残存在培养基中的葡萄糖比对照组明显增多，胰岛素抵抗形成。

参考文献

［1］郭晓农，杨具田， 牛峰等.胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞模型的建立及鉴定［J］.中药材，2008,31（2）：258-261［2］吴乃君，1973年9月出生，女，河北省唐山市人，副主任医师，博士学位，研究方向：糖尿病及慢性并发症。