白癜风患者淋巴细胞对自身抗原表位肽的免疫应答研究

周福波，李 强，强慧妮，崔婷婷，郭 森，杨钰琪，李春英，高天文

白癜风是一种常见的色素脱失性疾病，病因复杂。黑素细胞的杀伤、脱失是白癜风发病的效应环节，而CD8+T淋巴细胞对黑素细胞的杀伤作用已在多项研究中得到证实[1,2]。研究发现，在白癜风发病中，细胞毒性T淋巴细胞特异性识别的自身抗原主要来源于tyrosinase，gp100，Melan A/MART-1 等[3,4]。在对高加索人的研究中已经确定的白癜风抗原表位主要有以下几条HLA-A*0201限制性的短肽：tyrosinase369-377，3D、gp100 209-217，2M、gp100 280-288，9V、Melan A/MART-1 26-35，2L 以及 Melan A/MART-1 26-35[5,6]。但高加索人、印度人、中国汉族人等不同人种的主要组织相容性复合体（MHC）分子易感基因位点可能存在明显差异[7]。本研究的目的是对汉族进展期白癜风患者针对上述已知表位肽段的细胞免疫应答情况进行研究，明确其在汉族人白癜风发病中所起的作用，并通过对治疗前后免疫应答水平的比较，进一步明确与病情的活动和转归有无关联。

1 对象和方法

1.1 研究对象

102例研究对象均为我科门诊就诊的进展期白癜风患者，符合白癜风诊断标准[8]，病程在3个月内且病情快速进展，色素脱失范围大于体表面积5%，2个月内未行任何治疗。其中男45例，女57例，年龄6～54岁，平均年龄（27.6±10.7）岁，病程20～87 d，平均46 d。所有患者抽取10 ml全血进行检测，HLA-A*0201患者治疗1个月、3个月后复诊时再次抽血检测。

1.2 抗原表位肽段的合成

根据先前文献中已经报道的肽段[1,3-6]，由上海生物工程技术服务有限公司合成以下HLA*0201限制性短肽：tyrosinase369-377，3D ：YMDGTMSQV，gp100 209-217，2M: IMDQVPFSV，gp100 280-288，9V：YLEPGPVTV，MART-1 26-35，2L：ELAGIGILTV，MART-1 26-35：EAAGIGILTV，阳性对照肽段 flu 58-66：GILGFVFTL，以及无关肽段HIV p17Gag：SLYNTVATL。

1.3 方法

1.3.1 外周血单个核细胞（PBMC）分离 利用Ficoll密度梯度离心法进行外周血PBMC分离：将10 ml外周血与10 ml PBS混匀后逐滴滴入10 ml淋巴细胞分离液中，2 000 r/min离心20 min。吸出白膜层，用PBS稀释，混匀，1 000 r/min离心10 min。倒去上清，再次洗涤，细胞沉淀即为外周血PBMC。

1.3.2 DNA提取 利用北京TIANGEN基因组DNA提取试剂盒对所有患者提取外周血DNA后送至深圳华大临床检验中心有限公司基因行HLA-A位点分型检测。

1.3.3 ELISPOT实验 γ-干扰素 (IFN-γ) ELISPOT试剂盒购自瑞典MABTECH AB公司。无菌PBS清洗孔板后每孔加入200 l易得培养基室温封闭30 min。去除培养基，每孔加入2×105个PBMC，依次加入上述白癜风相关肽段(终浓度为10 g/ml)，同时设置阳性刺激孔(CD3 1:1 000) 、无关对照孔(HIV p17Gag SLYNTVATL)，每个患者设置3组重复。37℃，5%CO2恒温孵箱孵育36 h后弃细胞悬液，无菌PBS清洗5次。将7-B6-ALP链霉亲和素按照1:200稀释于含0.5%胎牛血清的PBS后每孔添加100 l室温孵育2 h。清洗孔板，每孔添加100 l BCIP/NBT底物液后常温避光放置，孔板显清晰斑点后即冲洗。晾干后利用读板仪计数斑点数。每2×105个PBMC中斑点形成细胞数目（SFC）为：孔内斑点数-同一患者无关肽段孔的斑点数。每孔的斑点形成细胞数目即为2×105个PBMC中可以特异性识别肽段的T细胞数。

1.4 统计学方法

采用Graphpad Prism 5软件对数据进行统计学分析及制图。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HLA-A位点分型

HLA-A为等位基因，102例进展期白癜风患者HLA-A位点分型结果及不同HLA-A位点限制性患者数见表1。 HLA-A*0201限制性患者占总例数的38.24%（39/102），非HLA-A*0201限制性患者占61.76%（63/102）。

表1 102例进展期白癜风患者HLA-A位点分型

2.2 ELISPOT实验结果

HLA-A*0201限制性患者与非HLA-A*0201限制性患者ELISPOT结果见图1。与非HLA-A*0201限制性患者相比，HLA-A*0201限制性患者对白癜风表位肽段、流感病毒肽段有较强的反应。

2.3 2例HLA-A*0201患者治疗前后细胞免疫水平

选取2例患者行窄谱中波紫外线（NB-UVB）照射、局部外用钙调磷酸酶抑制剂（他克莫司）治疗后明显缓解的HLA-A*0201患者追踪其细胞免疫应答变化，结果见表2。

第27号患者经过1个月的治疗后，针对2号、5号肽段的细胞免疫水平有所上升，而针对其他肽段的细胞免疫水平下降。经过3个月的治疗后，针对所有肽段的细胞免疫应答水平均有所下降。

图1 不同HLA-A分型的白癜风患者ELISPOT实验结果

第43号患者在经过1个月、3个月的治疗后，针对每一条白癜风相关肽段的细胞免疫应答水平均有所下降。

表2 2例HLA-A*0201患者治疗后细胞免疫水平变化

3 讨论

白癜风患者发病时自身反应性T淋巴细胞对黑素细胞的破坏已在多项研究中得到证实。而作为自身免疫反应的始动环节——自身抗原的识别，一直是白癜风自身免疫机制研究的热点。从1998年开始，相继有研究证实，在白癜风的发病中，患者的外周血PBMC可以特异性识别黑素细胞分化抗原，主要为tyrosinase、gp100、Melan A/MART-1[3-6,9]。但由于在不同的研究中患者人种、地区、疾病进展情况、HLA-A位点的不同，其得出的结论不完全一致。尤其是tyrosinase、Melan A/MART-1，对于其是否能够在白癜风发病中发挥自身抗原作用，目前结论尚不一致[3,5]。

近年来的高通量基因组学研究——GWAS研究证实，白癜风发病中同一分子的易感位点在不同的人群中存在着一定程度的差异。Birlea等[10]发现在高加索人群中，白癜风易感的基因位点主要位于MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ类分子上。而汉族人的白癜风易感位点与之不同[11]。考虑到不同的MHC分子对抗原肽的提呈不同，且目前尚不明确在高加索人白癜风患者的抗原表位肽段是否也为汉族白癜风人群的抗原表位。我们选取进展期白癜风患者进行细胞免疫应答的研究，以便更加客观地反映白癜风患者急性发病时的细胞免疫状况。

HLA分型方面，HLA-A*0201限制性患者所占比例最大（38.24%），其次为HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA-A*3001、HLA-A*0301、HLA-A*0206等，这与之前在汉族人群中进行的HLA-A易感位点分析是一致的[12,13]。通过利用5条不同的肽段刺激白癜风患者外周血PBMC，我们发现HLA-A*0201限制性患者对这5条肽段有着较高的应答反应，而非HLA-A*0201限制性的患者则对这些肽段反应较弱。说明已知的高加索人白癜风自身抗原肽段也能够被汉族易感人群的免疫细胞特异性识别，进而在白癜风的发病中发挥作用。而2例患者针对gp100 280-288，9V肽段特异性反应水平最高，这说明白癜风患者针对gp100有着较强的免疫反应，这与之前相关报道结果一致[3]。对2例患者治疗前后不同时间段细胞免疫水平进行比较，我们发现患者针对不同肽段的细胞免疫应答水平随着病情的好转有所下降，提示患者的病情变化与细胞免疫应答水平存在着一定程度的关联。有研究对18例进展期白癜风与6例稳定期白癜风患者细胞免疫功能进行比较，发现患者PBMC仅对gp100的识别在两组之间有所差异，进而得出仅gp100肽段的反应与疾病进展程度相关[3]。鉴于我们仅观察了2例患者治疗前后的变化，尚需要对更多患者的细胞免疫状况进行比较，方能得出更加客观的结论。

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