温州地区丙型肝炎病毒感染者基因型分布特征及其临床意义分析

林 荣 王 彬 刘燕飞

浙江省温州市中心血站，浙江温州 325000

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是黄病毒科肝炎病毒，为RNA正链病毒[1]。鉴于HCV基因组的变异性较大，故HCV存在不同的基因型。目前，根据Simmonds分型系统共有6个基因型，68个亚型。我国主要以 1a、1b、2a、2b、3a 基因型为主，且均有相关报道文献[2]。我国HCV感染率较高，平均为3.2%，该类感染可导致慢性肝炎、肝硬化、肝癌等病症，其临床症状的轻重程度与感染基因型相关，一般1b型较非1b型肝功能损害病情严重，易恶化[3-5]。因此，对HCV感染区分基因分型对于丙型肝炎的个体化治疗作用明显。本研究采用PCR技术对温州地区HCV感染者进行基因型研究，了解本地区患者主要基因型，以探讨HCV基因型的分布特征，并分析基因型与病情的关系，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集 2010年 1月～2012年 12月温州市中心血站（以下简称“我站”）自愿献血者244例，经ELISA方法证实HCV抗体阳性者122例，年龄23～56岁，其中男 68例，女 54例；健康者 122例，年龄 20～58岁，其中男70例，女52例。收集同期温州某医院门诊患者122例，其中，输血后丙肝 14例，男 4例，女 10例，年龄15～64岁；散发性丙肝 25例，男 15例，女 10例，年龄 17～60岁；肝硬化 40例，男 27例，女 13例，年龄11～69岁；原发性肝癌 43例，男 21倒，女 22例，年龄23～68岁。采集静脉血，全部血清标本均来自我站检验科及医院门诊患者。所有患者诊断均符合2000年9月西安第10次全国传染病与寄生虫病和肝病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》的标准：血清抗-HCV阳性、HCV RNA＞80 copies/mL，伴或不伴肝功能异常，均伴有不同程度的肝硬化。两组研究对象年龄、性别比例等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。且研究对象均知情同意，已经我站业务科通过。

1.2 试剂

全血RNA提取试剂盒（北京艾比根生物技术有限公司）；HCV抗体诊断试剂盒（北京科美东雅生物技术有限公司）；Taq酶、引物、RNA酶抑制剂（上海玉博生物科技有限公司）；M-MuLV逆转录酶（Simga公司）。

1.3 方法

1.3.1 PCR引物设计 自Genebank中查找HCV 1a、1b、2b、3a型全序列，查找各型 5′UTR 区共同序列，并以此自行设计引物。 外引物：S1 （nt34～54）：5′-ATCACTCCCCTGTGAGGAAC-3′；S2（nt279～299）：5′-CCCTATCAGGCAGTACCACA-3′；内引物：S3（nt39～59）：5′-TCCCCTGTGAGGAACTACTG-3′；S4 （nt274～294）：5′-TCAGGCAGTACCACAAGGCC-3′。

1.3.2 HCV RNA提取及AMV反转录 所收集的血清，12 000 r/min离心10 min，取上清，-70℃冰箱保存备用。利用Trizol法提取备用血清中的病毒RNA，具体操作方法为：于 30 μL血清中加入 Trizol溶液、氯仿及异丙醇，预冷振荡并洗涤，所得RNA于-70℃超低温冰箱中保存备用。另外在EP管中依次加入模板RNA、oligo（dT）16、dNTPmixture、RNase Inhibitor、AMV及 DEPC水，混匀均匀，42℃保温 1 h，95℃保温 5 min后冰上冷却后，行反转录。

1.3.3 巢式PCR扩增和酶切反应 于EP管中分别加入 cDNA 模板，Taq DNA 聚合酶，10×PCR buffer，上游引物（25 mmol/L）、下游引物 1μL，dNTP，灭菌去离子水，行扩增，并于 95℃预变性 4 min，95℃变性 30 s，55℃退火 30 s，70℃延伸 30 s，70℃延伸 5 min，进行35个循环后得到第1轮扩增产物。以其为模板，等同条件下行第2轮扩增。取第2轮PCR产物，分别加入19.5 μL Hae Ⅲ和 Bsh 1236Ⅰ及 buffer溶液，37℃水浴2 h，2%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS 15.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，等级资料采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-巢式PCR检测HCV-RNA结果

1b 阳性（144 bp）、2a阴性表达；1b 阴性、2a阳性（174 bp）表达；1b 阳性（144 bp）、2a 阳性（174 bp）表达，见图1。

图1 温州地区HCV分型凝胶电泳图

2.2 HCV-RNA基因分型结果

结果显示，所有研究对象中，门诊肝病患者1b总阳性率为100.0%，HCV抗体阳性者1b总阳性率为95.9%，健康者1b总阳性率为0.0%，三者比较，差异有统计学意义（χ2=10.28，P ＜0.05），提示该地区 1b基因型所占比例较大。见表1。

2.3 基因型与患者病情的关系

以门诊患者不同病变程度占比进行统计，结果显示，122例患者中1b型所占比例最高，且主要分布在重度病变及肝硬化患者中（P＜0.05），不同程度间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。提示1b型感染所致疾病病情较为严重。见表2。

表1 HCV-RNA基因分型结果[n（%）]

表2 基因型与患者病情的关系

3 讨论

HCV基因组变异明显，分型较多，平均每个位点的核苷酸变异频率每年可达0.001[6-7]。HCV不同基因型可影响患者的病情及其进展。本研究利用较为保守的5′UTR区进行RFLP法分型，对1a～6a不同基因型的cDNA扩增效果较为明显。不同地区的HCV基因分布不同，欧美国家主要为1a型，亚洲国家主要为1b型[8]。文献显示，1b基因型对疾病的影响较为严重，可导致肝坏死及纤维化，且该类病毒的复制能力较强，危险系数较大[9]。

HCV基因型分布存在地区差异。研究报道我国南方沿海城市1b型占90%以上，北方城市2a型占62%左右[10-11]。HCV包括多种基因型，将Okamoto和Simmonds提出的两种分类方法结合起来可以把HCV基因型分为Ⅰ/1a、Ⅱ/1b、Ⅲ/2a、Ⅳ/2b、Ⅴ/3a、4a、4b、4c、4d、5a和Ⅵ/6a，其中Ⅱ/1b和Ⅲ/2a是我国主要流行的基因型。人感染HCV后机体不产生保护性抗体，另外针对HCV感染也缺少有效的治疗药物。虽然干扰素是目前公认的抗HCV的有效药物，但是，国内外的研究资料表明，HCV基因型对干扰素有明显影响[7-8]。因此，在干扰素治疗前，提前测定患者所感染HCV的基因型对于治疗非常重要。另外，人感染HCV以后，肝脏疾病的严重程度也各异，这与所感染的HCV基因型也有关，所以研究HCV不同血清型在人群中分布情况可以为HCV的诊断和治疗等方面提供重要的科学依据。我国其他地区虽然进行了HCV基因型分布的探讨，但是在温州地区还未开展。关于浙江温州地区HCV不同基因型分布情况相关的研究不多。本研究结果显示，所有研究对象中，门诊肝病患者1b型总阳性率为100.0%，HCV抗体阳性者1b型总阳性率为95.9%，健康者1b型总阳性率为0.0%，三者比较，差异显著（P＜0.05），提示该地区 1b型所占比例较大。122例肝病患者中1b型所占比例最高，且主要分布在重度病变及肝硬化患者中（P＜0.05），不同程度间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。提示，1b型有较高的复制能力和血清反应性，较强的肝细胞损害作用及较低的IFN治疗反应性等，由其感染所致疾病病情较为严重，HCV基因型与特定的组织病理学程度、肝脏炎症程度相关。

综上所述，本研究在一定程度上反映了温州地区HCV基因型分布情况，对当地丙型肝炎患者的治疗和预后判断有一定的指导意义。但由于本研究对象例数不多，还不能完全反映温州地区HCV不同基因型具体分布情况，且研究对象以慢性肝病为主，缺乏无症状患者，有必要扩大样本量，选择人群资料进一步研究。

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