精索静脉曲张不育症患者精浆生化标志物与精子顶体酶的测定与分析

覃 湛 袁逸之 袁少英 胡晓莹 金明昱 耿立果

1.广东省中医院珠海医院男科，广东珠海 519015；2.北京师范大学-香港浸会大学联合国际学院，广东珠海 519085

WHO把精索静脉曲张（varicocele，VC）列为男性不育的首位原因[1]，在不育男性中发病率高达 25%-40%。有很多研究表明VC不育症与睾丸局部温度过高、精索静脉内压力增高、睾丸局部缺氧与pH值改变、肾上腺和肾静脉内的物质反流等因素有关，但确切原因未明确。由于精浆含有维持精子生存的各种营养成分，又是精子运动的必需介质；精子顶体酶是参与精子穿透卵子透明带的顶体反应中最重要的酶，因此，VC与精子的活动力、受精能力密切相关。本研究检测了VC不育症患者的精浆生化标志物与精子顶体酶的活性，为探讨VC不育症的发病机制提供一些实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

患者来源于2011年5月～2013年5月在广东省中医院珠海医院男科门诊就诊的不育症患者，随机选取VC不育症精液参数异常者（A组）136例，生殖系统感染性不育症但无VC且精液参数异常者（B组）34例，有VC精液参数正常者（C组）35例，另取无 VC且精液参数正常并已生育的体检健康者（D组）35例设为正常对照组。其中A组又根据VC的程度分为A1组（Ⅰ度）34 例、A2 组（Ⅱ度）35 例、A3 组（Ⅲ度）35 例、A4组 （亚临床型）32例，A组患者年龄平均 （33.17±3.83）岁，A1 组平均（33.86±2.16）岁，A2 组平均（34.21±4.23）岁，A3 组平均（33.21±2.39）岁，A4 组平均（32.93±4.63）岁，B 组平均（34.16±4.52）岁，C 组平均（33.81±4.01）岁，D 组平均（32.68±4.29）岁。 各组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），均有可比性。精索静脉曲张程度可根据触诊与彩超检查结果分为四度：Ⅰ度：触诊不明显，但Valsava方法检测阳性；Ⅱ度：触诊时容易触及扩张的静脉，但不易看见；Ⅲ度：能看见扩张的静脉成蚯蚓团突出在阴囊表现，容易摸到；亚临床型：触诊不明显，Valsava方法检测阴性，但彩超可见静脉反流[2]。本研究课题经广东省中医院医学伦理委员会审阅并通过，所有纳入的研究对象均知情同意，并签署知情同意书。

1.2 诊断及选择标准

1.2.1 诊断标准 参照WHO《人类精液及精子—宫颈粘液相互作用实验室检验手册》（第5版）、《不孕与不育》[2]制订：①夫妻同居1年以上，性生活正常而未孕。②精子浓度＜15×106/mL；前向运动精子（PR）＜32%。③阴囊下坠，青筋暴露，盘曲甚者触之蚯蚓团，睾丸或腹股沟疼痛，时易牵引少腹、会阴部；阴囊体检可触及VC：④符合附睾炎或慢性前列腺炎、精囊炎诊断，精液检查可见WBC、RBC，无精索静脉曲张。⑤彩超明确分辨VC或附睾炎、前列腺炎、精囊炎。⑥排除其他原因导致的不育症。凡同时符合上述①、②、③、⑤、⑥项者即诊断为VC不育症，符合①、②、④、⑤、⑥项者为生殖系统炎症性不育症。

1.2.2 纳入标准 ①符合VC不育症或附睾炎不育症的诊断标准；②年龄在25～45岁。

1.2.3 排除标准 ①年龄＜25岁或＞45岁；②患有其他影响生殖功能疾病者；③1个月内曾经服用其他治疗不育症的药物和接受其他相关治疗者。

1.3 精液标本采集与储存

禁欲2～7 d后取精，将通过手淫法采集的精液置无菌杯中，置37℃水浴箱中液化。将液化的精液通过离心机离心取精浆，置在3～5℃冰箱中保存。

1.4 检测方法

1.4.1 精液质量检测 采用WLJY-9000型精子质量检测系统 （北京伟力科技发展有限公司），严格按照WHO《人类精液及精子-宫颈黏液相互作用实验室检验手册》（第5版）的方法检测精液质量。

1.4.2 精浆生化标志物与精子顶体酶检测 精浆中性α-糖苷酶、锌、弹性硬蛋白酶、酸性磷酸酶、精子顶体酶定量检测试剂盒采用广东深圳华康生物药业工程有限责任公司产品，严格按照说明书操作。正常值：精浆中性 α-糖苷酶≥20 mU/一次射精；锌＞2.4 μmol/mL；弹性硬蛋白酶＜290 μg/L；酸性磷酸酶≥200 U/一次射精；精子顶体酶 48.2～218.7 μIU/一次射精。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 12.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，多组间的比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 精索静脉曲张不育症组与其他各组的精浆生化标志物与精子顶体酶的比较

A组与B组中性α-糖苷酶含量分别为（28.44±17.02）、（25.27±10.17）mU/一次射精，精子顶体酶含量分别为（70.20±49.02）、（50.93±38.64）μIU/106精子， 两组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；锌含量分别为（2.57±1.19）、（1.85±1.11）μmol/mL，弹性硬蛋白酶含量分别为（178.14±79.36）、（601.84±553.97）μg/L，酸性磷酸酶含量分别为（239.71±35.2）、（147.96±28.44）U/一次射精，两组相比，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；C 组中性 α-糖苷酶含量为（48.02±21.10）mU/一次射精，精子顶体酶含量为（138.46±99.14）μIU/106精子，与 A组相比，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；锌含量分别为（3.87±1.85）μmol/mL，与 A 组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；弹性硬蛋白酶含量为（182.01±108.64）μg/L、酸性磷酸酶含量为（270.11±31.03）U/一次射精，与A组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。D 组中性 α-糖苷酶含量为（50.82±20.85）mU/一次射精，锌含量为（3.90±1.62）μmol/mL，精子顶体酶含量为（146.78±90.59）μIU/106精子，与 A 组相比，差异有高度统计学意义 （P＜0.01）；酸性磷酸酶含量为（269.64±28.91）U/一次射精，与 A 组相比，差异有统计学意义 （P＜0.05）； 弹性硬蛋白酶含量为 （177.77±86.55）μg/L，与正常对照组相比，差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。 见表1。

表1 精索静脉曲张不育症组与其他各组的精浆生化标志物与精子顶体酶的比较（±s）

表1 精索静脉曲张不育症组与其他各组的精浆生化标志物与精子顶体酶的比较（±s）

注：与 A 组比较，△P ＜0.05，＊P ＜ 0.01

组别 例数 中性α-糖苷酶（mU/一次射精） 锌（μmol/mL） 弹性硬蛋白酶（μg/L） 酸性磷酸酶（U/一次射精） 顶体酶（μIU/106精子）A组13628.44±17.022.57±1.19178.14±79.36239.71±35.2170.20±49.02 B组3425.27±10.171.85±1.11＊601.84±553.97＊147.96±28.44＊50.93±38.64 C组3548.02±21.10＊3.87±1.85△182.01±108.64270.11±31.03138.46±99.14＊D组3550.82±20.85＊3.90±1.62＊177.77±86.55269.64±28.91△146.78±90.59＊

2.2 精索静脉曲张不育症各亚组精浆生化标志物与精子顶体酶的比较

精索静脉曲张不育症各亚组 A4组、A1组、A2组、A3组曲张程度逐渐加重，A1与 A2、A3与 A4等多组间比较，A1、A3组中性 α-糖苷酶含量分别为（31.87±20.45）、（21.57±7.15）mU/一次射精， 两组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），其余精浆生化标志物各指标与精子顶体酶含量两组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。A2与 A1、A3与 A4等多组间比较，A2、A4 组顶体酶含量分别为 （53.11±19.34）、（74.73±42.41）μIU/106精子，两组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），其余精浆生化标志物各指标两组相比，差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。A3 与 A1、A2、A4等多组间比较，A3、A4组中性 α-糖苷酶含量分别为 （21.57±7.15）、（34.12±19.34）mU/一次射精，两组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），顶体酶含量分别为（45.50±28.76）、（74.73±42.41）μIU/106精子，两组相比，差异有高度统计学意义（P ＜ 0.01）。A4与 A1、A2、A3组比较，A4与A1组精浆生化标志物各指标与精子顶体酶含量差异无统计学意义（P＞0.05）。A4与 A2、A3组顶体酶含量、A3、A4组中性 α-糖苷酶含量相比差异有统计学意义（P＜0.05）。其余精浆生化标志物各指标与精子顶体酶含量差异无统计学意义 （P＞0.05）。见表2。

表2 精索静脉曲张不育症各亚组精浆生化标志物与精子顶体酶的比较（±s）

表2 精索静脉曲张不育症各亚组精浆生化标志物与精子顶体酶的比较（±s）

注：与 A3比较，△P＜0.05；与 A4比较，#P＜ 0.05，##P＜0.01

组别 例数 中性 α-糖苷酶（mU/一次射精） 锌（μmol/mL） 弹性硬蛋白酶（μg/L） 酸性磷酸酶（U/一次射精） 顶体酶（μIU/106精子）A1组3431.87±20.45△2.70±1.23188.12±89.20243.02±29.6865.02±34.86 A2组3526.21±16.142.43±1.27186.79±87.44227.93±36.4153.11±19.34#A3组3521.57±7.152.32±1.01185.15±89.26218.99±36.8445.50±28.76##A4组3234.12±19.34△2.83±1.24187.85±88.84254.59±37.1174.73±42.41

3 讨论

精索静脉曲张在不育男性中发病率为25%～40%[1]，其导致男性不育的机制尚未完全阐明，临床上普遍认为与睾丸局部温度过高、精索静脉内压力增高、睾丸局部缺氧与pH值改变、肾上腺和肾静脉内的物质反流、免疫因素等有关。近来有关VC导致不育的细胞分子机制取得了两方面的重要进展：细胞凋亡异常氧化应激[3]。精浆含有维持精子生存的各种营养成分，又是精子运动的必需介质。精浆中最有代表性的标志物为中性α-糖苷酶、锌、弹性硬蛋白酶、酸性磷酸酶等。实验可见VC不育症患者与正常对照组相比，精浆的中性α-葡糖苷酶活性明显下降，而且从表2可见，随曲张程度加重，下降越明显，从而影响精子的活动力，首要原因是VC可引起睾丸、附睾内的氧化应激增多，附睾抗氧化机制异常[4]，导致活性氧（ROS）过度生成，一氧化氮升高，丙二醛的增加，进而导致过多的脂质过氧化反应发生而损伤生精细胞[5]；附睾上皮的凋亡增加影响附睾分泌功能。附睾的各个部分均有中性α-葡糖苷酶大量分泌，作为衡量附睾分泌功能的中性α-葡糖苷酶参与多糖分子内的 α-1、4糖苷键，可催化多糖或糖蛋白中的碳水化合物分解为葡萄糖并为精子代谢和运动供能。精子成熟、获能及受精过程伴有的比较活跃的糖基反应都与中性α-葡糖苷酶活性有关，其活性降低可直接导致精液质量下降[6]。VC患者精浆的中性α-葡糖苷酶活性下降的另一个原因，可能与精索静脉曲张改变了附睾的血流动力学、影响了附睾组织的正常代谢有关[7]。精浆锌、酸性磷酸酶含量下降，常见于慢性前列腺炎患者，VC患者精浆中的锌、酸性磷酸酶由前列腺分泌，酸性磷酸酶能参与精子代谢并有助于精子活力，其活性受雄激素调控。精浆锌对男性生殖功能有非常重要的作用，能通过延缓脂质过氧化而维持精子细胞膜的稳定性，从而保持精子活力，并可以清除由白细胞和有缺陷的精子产生的氧自由基，减少氧自由基对精子的毒性。本次实验可见VC可导致精浆锌、酸性磷酸酶下降的机制还不清楚，可能与VC导致的精浆氧化应激水平升高相关。不育症患者弹性硬蛋白酶含量升高，常见于生殖系统感染，如附睾炎、前列腺炎等，生殖道感染时，分叶核粒细胞参与吞噬病原体等抗炎反应，并分泌大量弹性硬蛋白酶至胞外，从而在精浆中表现。单纯VC不育症患者无感染，故本次实验VC组检测值明显低于附睾炎组。

精子的质量除了从精子的运动能力衡量外，还需要有较高的受精能力，即能完成顶体反应，穿过透明带进而和卵细胞融合，完成受精过程。VC患者的精子除了活动力异常外，其受精能力也下降，主要表现为精子顶体酶含量下降，从表2可见，随曲张程度逐渐加重，精子顶体酶含量下降越明显。精子要穿透卵细胞的透明带，必须完成顶体反应以溶解透明带，精子顶体酶则是参与顶体反应的重要酶类物质之一，在受精过程中起着非常重要的作用。顶体酶是与精子顶体膜相连的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，以酶原的形式储存在顶体内，在受精过程中起溶解透明带，为精卵结合提供条件的作用，顶体酶活性是反映活精子质量的重要指标[8]。实验可见，VC患者精液顶体酶显著低于正常对照组，可能是由于VC可导致精液中精子凋亡相关表型增加，包括精子质膜磷脂酰丝氨酸（phosphatidyl-serine，PS）外翻、线粒体功能障碍及精子核DNA损伤[9]。精子质膜的完整性是精子具备正常受精能的重要因素，质膜功能损害主要始于PS外翻，造成精子质膜的成熟障碍，位于精子顶体内层浆膜上的顶体酶活性随之下降，精子的受精能力受影响。

本研究显示，VC不育组中性α-糖苷酶活性、锌、酸性磷酸酶、精子顶体酶含量均下降，弹性硬蛋白酶影响不明显。随曲张程度加重，中性α-糖苷酶活性、精子顶体酶含量下降越明显，对精子的活动力、受精能力的影响也进一步加重，提示与VC不育症患者的精浆氧化应激的水平及生精细胞凋亡呈正相关。因而，临床上对VC不育症患者进行中性α-糖苷酶活性、锌、酸性磷酸酶、精子顶体酶进行检测，可充分了解VC对患者的损害程度，让医师采取正确的临床决策，并可作为治疗效果评价的一个有价值的指标。

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