右美托咪定预处理对大鼠肝脏缺血再灌注后急性肾损伤的影响

吴文峰 宁 雪 尧永华

广州医科大学附属肿瘤医院麻醉科，广东广州 510095

在肝移植或进行某些复杂的肝脏外科手术时，为了控制术中出血，常需要短暂阻断肝脏的血流，这就造成了肝脏的缺血再灌注损伤，导致肝功能的严重损害，继而导致脑、肺、肾的继发性损害[1]。右美托咪定是一种新型的高选择性α2肾上腺素能受体激动剂，其药理作用除了有镇静、催眠、抗焦虑和抑制交感神经作用外，现越来越多研究证明还具有脏器保护作用。Arslan等[2]研究表明，右美托咪定能减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤。斯研娜等[3]研究发现，右美托咪定预处理和后处理均可减轻肾缺血再灌注损伤，其机制与抑制细胞凋亡作用有关。但其在预处理后对大鼠肝脏缺血再灌注损伤后继发的急性肾损伤的保护尚未有研究。本研究通过使用右美托咪定预处理后，观察其对大鼠肝脏缺血再灌注后急性肾损伤的保护作用，探讨其保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

雄性 SD大鼠 30只，体重 220～300 g，由中山大学实验动物中心提供。空调室内饲养，室温（20±2）℃，相对湿度保持在（55±10）%，自由进食水，术前 12 h禁食，但不禁水。大鼠随机分为对照组（S组）、肝脏缺血再灌注组（IR组）、右美托咪定组（Dex组），每组各10只。

1.2 肝脏缺血再灌注模型的建立及处理

腹腔注射3%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉后，将大鼠仰卧位固定，专用小动物面罩吸氧。行尾静脉穿刺置管，置入24 G静脉留置针，腹部去毛消毒，腹正中线开腹，游离支配肝左叶及中叶的肝动脉、门静脉、胆管分支，无创血管钳夹闭行肝脏部分缺血，缺血60 min后恢复再灌注，然后用丝线逐层关腹置鼠笼中恢复，单笼饲养，禁食但不禁水，维持大鼠肛温36～37℃。

大鼠麻醉后，S组与IR组以1 mL/(kg·h)速度给予生理盐水静滴30 min，间隔2 h后S组仅行开腹手术，而IR组予肝脏缺血 1 h，再灌注 4 h；Dex组则在30 min内给予大鼠 6 μg/kg浓度为 0.25 μg/mL的右美托咪定，间隔2 h后行肝脏缺血1 h，再灌注4 h。

1.3 监测指标

再灌注4 h时，腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉后，腹主动脉放血处死，留取右肾及腹主动脉血5 mL。将血液3000 r/min离心10 min，离心半径为10 cm，分离血清，分装不同的Eppendorf管中，-20℃冰箱保存。应用7600型全自动生化分析仪测定血清尿素氨（BUN）和肌酐（Cr）水平。取右肾组织，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存。称取0.2 g肾脏组织，加入9倍磷酸盐缓冲液（PBS），冰浴中制成 10%组织匀浆液，3000 r/min离心10 min，离心半径为7 cm，取上清夜-80℃保存待测。参照ELISA检测试剂盒（R.D公司，美国）说明书检测肾组织肿瘤坏死因-α（TNF-α）含量。参照试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书采用化学比色法测定肾组织丙二醛（MDA）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性及髓过氧化物酶（MPO）含量。取肾脏组织，经10%甲醛固定，石蜡包埋。用切片机进行5 μm厚的连续切片，然后苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察肾组织病理学改变。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用 t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清BUN和Cr水平

IR组与S组和Dex组比较血清BUN和Cr明显升高（P＜0.05），S组和Dex组比较差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。 见表1。

表1 各组大鼠血清 BUN和 Cr水平（n=10，±s）

表1 各组大鼠血清 BUN和 Cr水平（n=10，±s）

注：与 S组比较，*P ＜ 0.05；与 Dex组比较，#P ＜ 0.05；BUN：血清尿素氮；Cr：肌酐；IR：缺血再灌注损伤

组别 只数BUN（mmol/L） Cr（μmol/L）S组103.53±0.6852.23±7.67 IR组107.58±0.96*#91.84±10.34*#Dex组104.18±0.7565.64±11.42

2.2 肾组织 TNF-α、MPO、SOD和MDA水平

IR组与S组和Dex组比较TNF-α、MDA水平和MPO 活性明显升高，SOD 活性明显下降（P＜0.05）；S组和Dex组比较各项指标差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠肾组织 TNF-α、MPO、SOD 和 MDA 水平（n=10，±s）

表2 各组大鼠肾组织 TNF-α、MPO、SOD 和 MDA 水平（n=10，±s）

注：与 S组比较，*P ＜ 0.05；与 Dex组比较，#P ＜ 0.05；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；MPO：髓过氧化物酶；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；IR：缺血再灌注损伤

组别 只数TNF-α（ng/L） MPO（U/g） SOD（U/mgprot） MDA（U/mgprot）S组1051.3±16.21.78±0.4610.91±2.861.28±0.56 IR组10238.4±42.7*#4.73±1.07*#7.48±1.23*#3.66±0.95*#Dex组1069.2±22.32.15±0.8210.21±2.131.98±0.61

2.3 肾脏HE染色切片

S组大鼠细胞结构正常。S组大鼠肾小球系膜区血管轻度充血，少量细胞空泡变性、肿胀。IR组大鼠肾小管血管充血明显，部分细胞水肿、空泡变性，间质血管充血，可见中性粒细胞浸润，个别细胞坏死。

3 讨论

根据药理学实验相关的换算公式[5]，大鼠用药剂量约为成人6.3倍。因此，本研究使用右美托咪定的剂量为6 μg/kg。在本研究里，Cr和BUN是反映肾功能的传统指标；TNF-a在缺血再灌注损伤过程中是一种十分重要的炎症介质[4]；MDA和SOD则是反映机体内氧自由基的生成和清除的情况；MPO是反映组织中中性粒细胞滞留及激活程度。通过观察这些指标来评估右美托咪定对肝脏缺血再灌注后的急性肾损伤的保护作用。

在本研究里IR组大鼠BUN、Cr水平明显升高，TNF-α、MDA水平和 MPO活性明显升高，SOD活性明显下降，且病理切片出现明显的细胞肿胀、变性及中性粒细胞浸润。表明肝脏缺血再灌注后大鼠的肾功能出现了明显损伤。其可能机制为：一方面，肝脏缺血再灌注损伤通过库普弗细胞激活TNF-α等炎症细胞因子，导致大量中性粒细胞在肾脏内浸润，激活的中性粒细胞释放大量氧自由基和蛋白酶等炎性因子；另一方面，氧自由基在肝脏缺血再灌注后引发肾损伤的过程中扮演重要角色[5]。它可以激活肾脏内的中性粒细胞，两者共同作用分泌大量的TNF-α等炎症细胞因子。最终导致肾脏微循环障碍，血管通透增加性，引发组织水肿，肾小管血管充血明显，部分细胞水肿、空泡变性，间质血管充血，严重损害肾功能。而在Dex组里，BUN、Cr、TNF-α、MPO、SOD、MDA 与 S 组比较差异无统计学意义，这说明右美托咪定能通过降低TNF-α的水平，减少由于炎症介质活化所产生的炎症反应级联效应；减少氧自由基含量（SOD活力增高减少MDA生成），抑制中性粒细胞聚集，从而减轻对肾脏功能的损伤。

药物预处理[6]（pharmacological preconditioning，PPC）因为其安全性和操作简单，近年成为研究热点。丁冠南等[5]研究表明，丙泊酚预处理可明显减轻肝脏缺血再灌注后急性肾损伤，其机制与抑制炎症因子的分泌，减轻氧化应激有关。陈晖等[7]也发现丙泊酚能减少氧自由基生成从而保护肾功能。而Jung等[8]和Lv等[9]的观点也支持本研究结果。

此外，右美托咪定是一种新型的高选择性α2肾上腺素能受体激动剂，能减弱外科手术引起的应激反应[10]，降低血浆儿茶酚胺浓度和血液循环中和组织局部的去甲肾上腺素浓度，避免了去甲上腺素诱导血管收缩导致的不利影响。当循环量减少时，这有助于维持肾血流量和肾小球滤过[11-12]。另有研究表明，右美托咪定可加肾小球滤过，增加肾脏的水和钠的排泄，增加尿量，从而对肾脏起到保护作用[13-14]。

综上所述，右美托咪定可通过抑制炎性因子TNF-α，减少氧自由基生成，抑制中性粒细胞聚集来保护肝脏缺血再灌注损伤后的肾功能损伤。此外，还可通过减弱应激反应，增加肾脏水钠排泄等作用保护肾功能，但其具体机制还需进一步研究。

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