文殊兰弱碱性生物碱的抗肿瘤活性研究

吴 迪，代岐昌，2，季宇彬，2，3

(1.哈尔滨商业大学生命科学和环境科学研究中心哈尔滨150076;2.国家教育部天然抗癌药物工程技术研究中心，哈尔滨150076;3.哈尔滨商业大学药物研究所博士后科研流动站，哈尔滨150076)

文殊兰(Crinum asiaticum var.sinicum(Roxb ex Herb.)Baker)，最早记载于《本草纲目拾遗》，为石蒜科(Amaryllidaceae)文殊兰属(Crinum)多年生草本植物，主要分布在我国东南沿海地区，性味苦、辛、凉，有小毒;功在行血散瘀，消肿止痛，清火解毒［1］.民间主要用于治疗咽喉肿痛，跌打损伤，痈疽疖疮，毒蛇咬伤等.

现代药理研究已初步确定，文殊兰具有消炎、镇痛、保护心血管、诱导肿瘤细胞的凋亡以及抗拟胆碱样作用等作用［2］.文殊兰提取物活性成分中石蒜碱具有抑制肿瘤细胞的活性;体外实验表明，石蒜碱对人乳腺癌细胞、人结肠癌细胞、人离体鼻咽癌细胞等有明显的抑制作用，其作用机制可能是抑制DNA和蛋白质的合成［3］.石蒜碱可以将HL－60细胞阻断在G2/M期，其作用机制是下调Bcl－2的表达，提高Bax/Bcl－2的比率;增强caspase－8、caspase－9和caspase－3的活性，从而使细胞凋亡［4］.石蒜碱诱导KM3细胞凋亡的机制包括将细胞阻滞在G0/G1期;提高Bax的表达，降低Bc－l 2的表达;激活caspase－8、caspase－9和 caspase－3以及促使线粒体释放细胞色素C［5］.石蒜碱抑制小鼠淋巴瘤细胞L5178以及具有耐药性的小鼠淋巴瘤细胞增殖的机制与mdr－1基因的表达产物p－糖蛋白无关，而是由于和RNA形成了一种复合物［6］.本实验通过MTT法对文殊兰弱碱性生物碱的抑瘤率进行了研究测定，通过对比，筛选出了敏感细胞株并观察凋亡形态，为今后的深入实验奠定了基础.

1 主要材料和仪器

肿瘤细胞株:MCF－7细胞株、SMMC7721细胞株、SGC7901细胞株、HepG－2细胞株(哈尔滨商业大学药物研究所);

药品:羟基喜树碱注射液(哈尔滨盛泰药业)、胎牛血清(FCS)(杭州四季青生物工程公司)、Hoechst33258(碧云天试剂公司)、溴化四氮唑蓝(MTT)(Sigma公司);

仪器:Olympus IX70倒置显微镜、CKX－41－32荧光倒置显微镜、C－4040Z00M型数码相机(Olympus公司)、WELLSCAN MK3型酶标仪(Bio－Rad公司)、SANYO MCO175型CO2培养箱(日本三洋公司).

2 实验内容

2.1 细胞培养

将实验所用肿瘤细胞用含10%小牛血清RPMI－1640培养液培养，并置于含5%CO2的37℃培养箱中进行传代;用0.25%胰酶消化，每周传代2次.

2.2 MTT法筛选敏感的肿瘤细胞

取对数生长期的待测细胞，调整细胞浓度至5×104个/mL，接种于96孔培养板，每孔加入100 μL细胞悬液，于CO2培养箱中培养24 h后加入药物，使终质量浓度分别为 1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL，阴性对照组仅加入不含小牛血清的RPMI1640全培养基，阳性对照组加入羟基喜树碱(20 μg/mL).分别给药培养48 h(72 h)后，每孔加入MTT溶液，37℃孵育4 h，弃上清液，加DMSO溶解后，于490 nm测定吸光度.

2.3 荧光显微镜观察细胞凋亡形态

将细胞调至浓度1×104个/mL，转移至六孔板培养，每孔加入1 mL细胞悬液.培养24 h后加入药物，使终浓度分别为5、10、20 μg/mL，阴性对照组仅加入含RPMI1640全培养基，阳性对照组加入羟基喜树碱20μg/mL.培养48 h后，吸出废液，每孔加入固定液，固定30 min，PBS洗2次，每次洗3 min，加入Hoechst 33258染液，37℃避光染色30 min，使用荧光显微镜观察并记录图像.

3 实验结果及讨论

实验通过MTT法对文殊兰弱碱性生物碱的抑瘤率进行了研究测定，结果如图1，可以看出文殊兰弱碱性生物碱对肿瘤细胞生长有明显的抑制作用，而且呈现出剂量关系.通过计算IC50，结果如表1，发现文殊兰弱碱性生物碱对HepG－2细胞的抑制作用最为明显，因此，选择HepG－2细胞作为敏感细胞株进行肿瘤细胞凋亡实验.采用 Hoechst33258法观察不同质量浓度文殊兰弱碱性生物碱对HepG－2细胞凋亡形态变化的影响，在荧光显微镜下记录的图像结果如图2.可观察到细胞凋亡的凋亡小体以及凋亡的出现，而且细胞数也随着给药量增加而减少.

表1 MTT法检测文殊兰弱碱性生物碱对四种细胞生长的抑制作用

图1 文殊兰弱碱性生物碱对不同肿瘤细胞抑制曲线

4 结语

通过MTT实验发现文殊兰中弱碱性生物碱能够抑制SGC7901、SMMC7721、HepG －2、MCF －7四种肿瘤细胞的增殖，并且通过计算IC50得出HepG－2细胞对文殊兰弱碱性生物碱最敏感(IC50=9.37μg/mL).通过荧光显微镜观察给药HepG－2细胞发现，文殊兰弱碱性生物碱能够诱导肿瘤细胞特征性形态逐渐明显，并且有凋亡小体的出现.说明文殊兰弱碱性生物碱具有抗肿瘤活性，为本课题深入研究其凋亡机制提供了数据支持.

［1］江苏新医学院.中药大辞典(上册)［M］.上海:上海科学技术出版社，1993:1359.

［2］秦昆明，李 笑，徐 昭，等.石蒜碱及其衍生物的药理作用研究概况［J］.北京联合大学学报:自然科学版，2009，23(1):6－9.

［3］杨 月，陈建荣.文殊兰叶氯仿提取物诱导NCI－H460细胞凋亡研究［J］.肿瘤防治研究，2011，38(6):628－631.

［4］LIU J，HU W X，HE L F，etal.Effects of lycorine on HL －60 cells via arresting cell cycle and inducing apoptosis［J］.Federation of European Biochemical Societies，2004，578(3):245 －250.

［5］LI Y，LIU J，TANGL J，etal.Apoptosis induced by lycorine in KM3 cells is associated with the G0/G1 cell cycle arrest［J］.Oncology reports，2007，17(2):377 －384.

［6］HOHMANN J，FORGO P，MOLNAR J，etal.Antiprolif erativeamary llidace－aealkaloids is olated from the bulbs of Sprekelia formosissima and Hymenocallisx festalis［J］.Planta Medica，2002，68(5):454－457.