HPLC法测定乌蕨中原儿茶酸及原儿茶醛的含量

陈 明 段 萍 徐作刚 万红才

1.黔南州民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000;2.黔南州食品药品检验所，贵州 都匀 558000

乌蕨Stenoloma chusanum(L.)Ching为鳞始蕨科乌蕨属的多年生草本植物，别名乌韭、石发、土川连、孔雀尾、大叶金花草、小叶野鸡尾、蜢蚱参、细叶凤凰尾等，分布较为广泛，是一种常见的中草药。其具有一定的抗菌活性，有“万能解毒药”之称［1-3］。乌蕨中含有荭草苷、荭草苷-2-O-B-D-吡喃葡萄糖苷、牡荆素、芹菜素、丁香酸、原儿茶酸、原儿茶醛、香草酸和龙胆酸等化合物。目前采用紫外分光光度法测定乌蕨中总黄酮、总酚酸含量［4-7］。未见报道测定原儿茶酸、原儿茶醛的含量。为此，本文采用HPLC法测定乌蕨中原儿茶酸、原儿茶醛的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-2010A高效液相色谱仪;Agilent1260高效液相色谱仪;岛津2401紫外分光光度计;SK250LHC超声波清洗器 (上海科导仪器有限公司);梅特勒AG135、AL204电子天平。

1.2 试剂与材料 原儿茶酸 (批号:0809-200604)、原儿茶醛 (批号:110810-200506)对照品由中国药品生物制品检定所提供;乙腈 (色谱纯)、水为娃哈哈纯净水、其余试剂均为分析纯。乌蕨样本共7批，自然干燥10天后，地下部分洗净，全草于90℃干燥5小时，取地上部分、地下部分分别粉碎，过10目筛，即得供试样品，见表1。

表1 乌蕨样本采集表

2 方法与结果

2.1 色谱条件［8-13］色谱柱:迪马 Diamonsil ODS C18(4.6mm × 150mm，5μm)、Agilent ODS C18(4.6mm ×250mm，5μm);流动相:0.4%磷酸溶液 (A)-乙腈(B)，梯度洗脱，0～20min，98%-92%A;20～35min，92%-98%A;35～40min，98%A;流速:1.0ml/min;进样量:5μl;柱温:30℃;检测波长:280nm。理论板数以原儿茶醛峰计算应不低于3000。

2.2 对照品溶液配制 精密称取原儿茶酸、原儿茶醛对照品适量，加65%乙醇制成每1ml含原儿茶酸0.08mg、原儿茶醛0.03mg的溶液。

2.3 供试品溶液配制［14、15］取供试样品约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入65%乙醇50ml，称定重量，加热回流60分钟，放冷，再称定重量，用65%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 峰纯度考察 取对照品溶液、供试品溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，依法测定。结果表明:对照品原儿茶醛的紫外扫描图在280nm处有最大吸收，原儿茶酸的紫外扫描图在260nm处有最大吸收，在280nm处有较大吸收。乌蕨供试液中原儿茶酸、原儿茶醛峰的紫外扫描图与对照品原儿茶酸、原儿茶醛峰的紫外扫描图谱一致，且达到纯度要求。

2.5 线性关系考察 精密称取原儿茶酸10.11mg置10ml量瓶中，加65%乙醇溶解并稀释至刻度，精密量取2ml置25ml量瓶中，加65%乙醇溶解并稀释至刻度;原儿茶醛对照品10.05mg置100ml量瓶中，加65%乙醇溶解并稀释至刻度，精密量取3ml置10ml量瓶中，加65%乙醇溶解并稀释至刻度，得原儿茶酸 (0.08088mg/mL)、原儿茶醛(0.03015mg/ml)对照品溶液。精密吸取原儿茶酸、原儿茶醛对照品溶液2、5、8、10、15μl，注入液相色谱仪，按“2.1项”下的色谱条件测定，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，质量数 (μg)为横坐标进行线性回归计算，原儿茶酸、原儿茶醛线性回归方程分别为:A=1731800.51C-787.30(r=0.99996)、A=46117473.35C-1951.57(r=0.99996)。且原儿茶酸在0.1618-1.213μg/ml内呈良好的线性关系;原儿茶醛在0.06030-0.4522μg/ml内呈良好的线性关系。

2.6 精密度考察 精密吸取“2.5项”下原儿茶酸、原儿茶醛对照品溶液5μl，连续进样6次，测定峰面积，原儿茶酸、原儿茶醛峰面积的RSD分别为0.10%、1.06%，结果表明此方法有良好的精密度。

2.7 稳定性考察 取供试品溶液分别于0、4、8、12、16、24h进样，进样量5μl，测定原儿茶酸、原儿茶醛峰面积，原儿茶酸、原儿茶醛峰面积的 RSD分别为0.89%、1.22%，说明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.8 重复性考察 取供试样品，按“2.3项”下方法配制6份供试品溶液，按“2.1项”下方法，测定峰面积。原儿茶酸、原儿茶醛的平均含量为2.0938mg/g、0.9221mg/g，RSD分别为1.74%、0.78%。

2.9 加样回收率试验 精密称取6份已测定含量的样品1.0g(原儿茶酸、原儿茶醛的平均含量为2.0938mg/g、0.9221mg/g)，置具塞锥形瓶中，精密加入原儿茶酸、原儿茶醛混合对照品溶液［精密称取原儿茶醛对照品10.05mg，置100mL量瓶中，精密量取50ml置500ml量瓶中，另精密称取原儿茶酸对照品10.33mg置同一500ml量瓶中，加65%乙醇溶解并稀释至刻度，制得原儿茶酸、原儿茶醛混合对照品溶液 (0.02066mg/ml、0.01005 mg/ml)］50ml，称定重量，加热回流60分钟，放冷，再称定重量，用65%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，进样5μl，记录色谱图，另取“2.5项”下原儿茶酸、原儿茶醛对照品溶液 5μl，同法测定。平均回收率分别为 96.70%，96.18%;RSD分别为1.30%，1.10%。结果见表2。

表2 乌蕨中原儿茶酸、原儿茶醛的回收率实验结果

2.10 样品测定 取供试样品 (地上部分与地下部分)分别配制供试品溶液，进样5μl，记录峰面积，测定含量。见表3、表4。

表3 乌蕨 (地上部分)原儿茶酸、原儿茶醛测定结果 (n=3)mg/g

表4 乌蕨 (地下部分)原儿茶酸、原儿茶醛测定结果 (n=3)mg/g

3 讨论

3.1 采挖季节对乌蕨中原儿茶酸、原儿茶醛的含量有影响，冬季原儿茶酸、原儿茶醛含量下降约一半;地上部分含原儿茶酸、原儿茶醛的含量比地下部分高约1倍以上。

3.2 比较65%乙醇、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮作溶剂，加热回流1小时制备的供试品溶液，以65%乙醇制备的供试品溶液所测原儿茶酸、原儿茶醛的含量最高;65%乙醇作溶剂，加热回流与超声各1h，加热回流所测原儿茶酸、原儿茶醛的含量较高。

［1］秦仁昌.中国植物志 (第2卷) ［M］.北京:科学出版社，1959:275-279.

［2］江苏新医学院.中药大辞典 (上册) ［M］.上海:上海人民出版社，1977.

［3］陈明，陈金秀，段萍.乌蕨的毒理学系列研究 ［J］，中医药学报，2000，28(6):48-50.

［4］蔡建秀，黄艳艳，许婉珍.乌蕨黄酮类化合物薄层层析及紫外光谱研究［J］.泉州师范学院学报，2005，23(6):82-86.

［5］蔡建秀，黄艳艳，许婉珍.乌蕨黄酮类化合物薄层成分分析［J］.海峡药学，2006，29(1):99-103.

［6］吴晓宁，张春椿.乌蕨不同部位总黄酮和元素的分析［J］.浙江中医药大学学报，2009，33(4):587-588.

［7］陶晨，杨小生，罗载刚，等.乌蕨中抑菌活性成分核磁共振波谱分析［J］.贵阳医学院学报，2004，29(6):495-496.

［8］吴晓宁，张春椿，吴巧凤.乌蕨总黄酮超声提取工艺的研究［J］.中国中医药科技，2007，14(3):190-191.

［9］张春椿，熊耀康，顾芳芳，等.乌蕨总黄酮提取工艺研究［J］.中国药业，2008，17(2):42-43.

［10］YBZ11072004，丹参注射液［S］.

［11］何昱，成金乐，徐吉银，等.HPLC-DAD同时测定丹参中原儿茶醛、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮ⅡA四种成分的含量［J］.世界科学技术中医药现代化，2011，12(4):688-691.

［12］贾恒明，刘敏，张良，等.HPLC法测定狗脊补肾片中原儿茶酸和原儿茶醛的含量［J］.解放军药学学报，2006，22(6):448-450.

［13］谢艳，罗锐，何智建，等.狗脊炮制工艺的研究［J］.临床医学工程，2011，18(7):1096-1098.

［14］龚晓莉，罗娅君，史东林，等.抗菌植物乌蕨中总酚酸含量的测定［J］.绵阳师范学院学报，2009，28(11):41-44.

［15］李明芳，罗娅君，李辉容.大叶金花草黄酮类化学成分的研究［J］.四川师范大学学报，2009，36(3):358-360.