山东地区153例汉族丙型肝炎患者HCV基因分型研究＊

刘义庆，田文君，渠 滕，刘春梅，许 丽，王盛华，朱之炜，张炳昌△（.山东大学附属省立医院检验科，济南 500 ；.山东大学第二医院肝病科，济南 500 ；.山东省济南市体外诊断试剂工程技术研究中心 500）

丙型肝炎病毒（HCV）感染是一个世界性的传染病，全球大约有1.7亿人被感染，我国 HCV感染者约4 200 万人［1］。HCV慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化、肝癌等终末期肝脏疾病，严重威胁人类健康。HCV是单股正链RNA病毒，极易发生基因变异，根据其核苷酸序列的差异，可分为6种HCV基因型及不同亚型，根据2005年新的HCV基因型命名规则，以阿拉伯数字表示HCV基因型，以小写英文字母表示基因亚型。HCV基因分型方法主要包括直接测序法、限制性片段长度多态性分析法（RFLP）、特异性引物聚合酶链反应（PCR）法、特异性探针荧光PCR法、基因芯片法等［2］。HCV基因组的E1、NS5b、C区直接测序和树分析是最准确、最经典的检测方法，为HCV基因分型的“金标准”［3］。为了解近年来山东地区汉族丙型肝炎患者HCV基因型分布情况，本研究通过焦磷酸测序法对153例山东地区汉族丙型肝炎患者进行HCV基因分型，以期为山东地区汉族人群丙型肝炎的诊治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选择2013年5月至2013年10月山东省立医院门诊及住院的153例丙型肝炎患者，均为山东地区汉族且均未接受过抗病毒治疗。其中男71例，女82例，年龄16～93岁，平均年龄（46.17±18.37）岁。

1.2 方法 无菌采集外周静脉血5mL，乙二胺四乙酸二钠（EDTA－K2）抗凝，在收集后2h内，室温下3 000 r／min离心8 min，将血浆转移到无菌离心管中，－70℃保存留做 HCVRNA检测。RNA检测结果大于103IU／mL的标本进一步做焦磷酸测序并做HCV基因分型。

1.2.1 HCV－RNA检测 采用实时荧光定量逆转录PCR（FQ－RT－PCR）技术，HCV核酸定量检测试剂盒由罗氏诊断产品有限公司（上海）提供，仪器为COBAS AmpliPrep－COBAS TaqMan48。由基因扩增实验室工作人员严格按照说明书操作，每次实验中均设置临界阳性、强阳性对照和质控，HCVRNA检测的线性反应范围为43～6.9×107IU／mL，检测下限为15IU／mL。

1.2.2 HCV基因测序和分型 采用德国Qiagen公司Pyro－Mark Q24型焦磷酸测序－遗传分析系统对RNA检测结果大于103IU／mL的标本进行基因测序和分型，该系统包括序列分析仪PyroMark Q24、用于制备单链DNA的PyroMark Q24真空工作站、分析用的PyroMark Q24软件以及相关试剂，严格按照说明书进行操作。

1.3 统计学处理 首先对HCV－RNA病毒载量数据进行对数转换（log10），再用SPSS21.0软件对数据进行统计分析处理，运用单因素方差分析比较HCV各亚型之间病毒载量是否有统计学差异；以α＝0.05为检验水准，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HCV基因分型结果 本次研究共检出5种HCV基因亚型，分别为 1a、1b、2a、3a、3b，所占比例依次为3.92%（6／153）、65.36%（100／153）、28.76%（44／153）、1.31%（2／153）、0.65%（1／153）。以1b为主，其次为2a，1a、3a、3b少见，未检出其他基因亚型。

2.2 HCV基因亚型病毒载量分析 运用单因素方差分析，对HCV基因亚型之间病毒载量是否存在差异进行统计学分析，结果F＝4.376，P＝0.006，即各 HCV基因亚型之间病毒载量不全相同。多重比较（LSD方法）表明1b亚型病毒载量明显高于2a亚型，差异有统计学意义（P＜0.05）。而1a与1b、2a、3a之间，1b与3a之间，2a与3a之间病毒载量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），详见表1。

表1 各HCV基因亚型病毒载量水平（）

表1 各HCV基因亚型病毒载量水平（）

注：－表示无数据；与2a亚型比较，aP＜0.05。

分型HCV－RNA单因素方差分析（IU／mL，×106） LSD法（log10）1a 2.54±3.06 5.91±0.86 1 b 3.08±4.79 5.91±0.98a 2a 7.48±9.54 5.28±0.96 3 a 2.05±2.69 5.89±1.00 3 b－－

3 讨 论

HCV感染主要通过输血或血液制品传播，目前HCV在全世界的感染率约为2%，我国约为3.2%。对于HCV感染目前还无有效的疫苗和治疗方法，不同的HCV基因型生物活性不同，病情进展和抗病毒治疗时间和疗效也不尽相同。HCV基因分型检测有助于了解地域分布，探讨其传播途径和发展。

由于人群遗传背景、人员流动性等不同，HCV基因型分布呈明显的国籍和地域差异［4］。美国、巴西和欧洲西北部以1a型占绝大多数；亚洲、远东、欧洲东西部以1b型为主；2a和2b型多分布于亚洲和欧洲；新加坡、泰国3a型多见；4a多见于中东和北非；5a局限于南非；6a常见于香港、越南等亚洲南部。中国大陆大部分地区HCV基因型以1b和2a型为主，其中1b型占70%～80%，在部分南方城市甚至高达90%，自南向北2a型所占的比例逐渐增多。本研究表明，近年来山东地区汉族丙型肝炎患者HCV基因分型以1b为主，2a型次之，与吉林、上海、福建等中国大部分地区报道相似［5－7］，与甘肃地区2a型较1b型更常见不同［8］，也与广东地区6a型高于2a型成为仅次于1b型的常见亚型不同［9－10］，说明中国大陆地区的HCV基因型存在区域性分布。

现有研究表明HCV基因型与疾病进展、干扰素治疗效果密切相关［11］。本文研究发现1b亚型组病毒载量明显高于2a组，差异有统计学意义（P＜0.05），这与前期研究结论一致。1b型病毒复制能力较强，对干扰素的持续病毒学应答（SVR）较低，仅为20%左右，更易发展为慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。干扰素对2a型治疗效果要明显好于1b型，其SVR率可达67%［5］。可以看出，HCV基因分型有利于临床医师针对患者感染的基因型制定个体化治疗方案，提高治疗效果。本研究中其他亚型之间病毒载量未发现统计学差异，可能与其他亚型例数较少有关。

本文采用焦磷酸测序法对山东地区153例汉族丙型肝炎患者进行HCV基因分型，并对不同基因型之间的病毒载量进行了分析，发现山东地区汉族丙型肝炎患者基因型以1b和2a为主，且病毒载量1b明显高于2a，这为山东地区汉族人群丙型肝炎的预防、诊断和治疗提供理论依据和帮助。

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