某国产D－二聚体试剂的临床验证研究

马艳侠，张建平，穆彦龙（.陕西中医学院附属医院检验科，陕西咸阳 7000 ；.咸阳市中心医院医学检验科，陕西咸阳 7000）

D－二聚体（D－D）是交联纤维蛋白特异性降解产物，是反映凝血和纤溶系统功能的指标，主要用于高凝状态和继发性纤溶亢进的诊断［1］。目前还没有国际约定的D－D参考测量程序和校准品，商品化检测试剂采用胶乳凝集法、酶联免疫吸附试验、胶体金显色法、胶乳免疫比浊法等方法。每种方法各有优缺点，灵敏度和特异度也有很大差别。即使采用相同检测方法的不同厂家试剂，采用的参考测量程序和校准品溯源性也有所不同，导致其线性范围、参考区间存在差异。D－D最常用的检测方法为胶乳免疫比浊法，以全自动血凝仪进行检测［2］。本研究通过比较国产试剂和进口试剂的检测性能，旨在确定国产试剂的精密度、准确度，以及建立适用于本地区人群的参考区间。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2013年1～12月于陕西中医学院附属医院以及陕西省咸阳市中心医院就诊的患者38例纳入患者组，男20例、女18例，年龄18～75岁，包括手术后9例、产科8例、肝硬化4例、卵巢癌4例、乳腺癌3例、肺栓塞3例、脑血管疾病3例、急性心肌梗死2例、尿毒症2例。同期体检健康者162例纳入对照组，男84例、女78例，年龄10～70岁，无心、肺、肝、肾等器质性疾病，无糖尿病、高血压、肿瘤等病史，排除妊娠期女性。年龄、性别等一般资料组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 仪器与试剂 日本Sysmex公司CA1500全自动血凝仪。国产胶乳免疫比浊法D－D检测试剂（A试剂）购自国内某生物科技有限公司，批号20101019 。进口胶乳免疫比浊法D－D检测试剂（J试剂）及配套校准品、质控品购自日本积水医疗株式会社，批号分别为819RHH、811RIH、815RHH。

1.3 方法

1.3.1 标本采集与检测 采集所有受试对象晨起空腹静脉血至含有0.109mol／L枸橼酸钠的抗凝管中（枸橼酸钠与血液比例为1∶9），30min内以3 000 r／min离心10min分离血浆标本，2h内采用A、J试剂进行D－D检测，检测方法参照仪器及试剂说明书。以J试剂作为对照试剂。

1.3.2 质量控制 采用线性回归法校准试剂后进行低值及高值质控品检测。在1d之内取3瓶质控品，采用两种试剂检测低值及高值质控品各10次，计算批内精密度（以CV%批内表示）；连续10d，每天采用两种试剂检测低值、高值质控品各1次，计算批间精密度（以CV%批间表示）。在确认质控品检测结果在控制范围内后进行受试对象标本检测。

1.4 统计学处理 采用SPSS20.0进行数据处理和统计学分析。符合正态分布计量资料以表示，偏态分布计量资料以中位数、四分位间距或百分位数表示。两种试剂批内、批间精密度数据均为正态分布且方差齐性，组间比较采用两独立样本t检验。两组受试对象临床标本检测结果的差值为非正态分布，组间比较采用配对设计Wilcoxon符号秩和检验。显著性检验水准α＝0.05，P＜0.05为比较差异有统计学意义；等效性检验采用置信区间推断法，显著性水准α＝0.05，为双单侧检验，等效界值δ为J试剂检测结果标准差的1／5，等效区间为－δ～δ，如果两组总体均数之差的（1－2α）×100%，即双侧90%置信区间（90%CI）位于等效区间内，认为两组试剂等效。

2 结 果

2.1 质控品检测批内精密度分析 以A试剂和J试剂分别检测低值、高值质控品各10次，批内精密度比较差异均无统计学意义（P值分别为0.087、0.238），见表1。两组数据均为正态分布（A试剂W 值分别为0.935、0.944，P值分别为0.504、0.596；J试剂 W 值分别为0.955、0.965，P 值分别为0.732、0.839），且方差齐性（F 值分别为0.003、0.249，P 值分别为0.955、0.624）。

表1 两种试剂D－D质控品检测批内精密度比较

2.2 质控品检测批间精密度分析结果 以A试剂和J试剂对低值、高值质控品进行连续10d的检测，批间精密度比较差异均无统计学意义（P 值分别为0.274、0.318），见表2。两组数据均为正态分布（A试剂W 值分别为0.902、0.932，P值分别为0.228、0.466；J试剂W 值分别为0.986、0.922，P 值分别为0.990、0.373），且方差齐性（F 值分别为0.592、0.048，P 值分别为0.452、0.829）。

表2 两种试剂D－D质控品检测批间精密度比较（）

表2 两种试剂D－D质控品检测批间精密度比较（）

组别 n 低值（，μg／mL）CV%批间（%）高值（，μg／mL）CV%批间（%）10 2 .39±0.11 4.60 8.29±0.16 1.93 J试剂组A试剂组10 2 .46±0.14 5.69 8.37±0.18 2.15

2.3 参考区间验证结果 以对照组标本A试剂检测结果进行D－D 95%参考区间验证。数据不满足正态性（W＝0.952，P＝0.000），呈右偏态分布，采用百分位数法计算双侧95%参考区间，即X2.5%～X97.5%为（0.14～0.97）μg／mL。

2.4 临床标本两种试剂检测结果比较 200例临床标本，A试剂D－D检测结果的中位数、四分位间距分别为0.51、0.50 μg／mL，J试剂D－D检测结果中位数、四分位间距分别为0.53、0.40μg／mL，组间比较差异无统计学意义（Z＝－0.517，P＝0.605）。A、J试剂检测结果配对差值为非正态分布（W＝0.583，P＝0.000），中位数、四分位间距分别为－0.02、0.19 μg／mL。采用配对设计Wilcoxon符号秩和检验。A试剂D－D检测结果均值、标准差分别为1.85、5.43μg／mL，J试剂 D－D检测结果均值、标准差分别为1.83、5.22μg／mL，则等效性检验等效区间为－1.04～1.04，两组总体均数之差的双侧90%CI为－0.85～0.89，位于等效区间内，可认为两组试剂等效。

3 讨 论

胶乳免疫比浊法检测D－D的原理是以D－D单克隆抗体包被乳胶颗粒，标本中的D－D与之产生特异的抗原抗体反应，使颗粒凝集而增加反应液的浊度，将浊度的变化与校准曲线进行比较，即可获得标本中D－D的定量检测结果。胶乳免疫比浊法D－D检测具有反应速度快、定量准确、敏感度高等特点，并且可以和常规凝血项目同时检测，因此广泛应用于自动化血凝仪［3］。

D－D水平反映体内凝血－纤溶系统活化状况，与多种疾病密切相关，可用于深静脉血栓、肺栓塞、弥散性血管内凝血、血栓疾病的诊断、溶栓疗效观察，在肝炎、心血管疾病、恶性肿瘤等领域也有一定的应用价值。受诸多因素的影响（如方法学、试剂成分等），不同D－D检测试剂的线性范围、参考区间等存在一定的差异［4］。受试者年龄、生理变化、是否妊娠、药物治疗等因素对D－D检测结果也存在一定的影响［5］。

本研究采用日本Sysmex公司CA1500型全自动血凝仪对国产D－D检测试剂的性能进行了验证，并建立了适合本地区的参考区间。研究结果显示，该国产试剂检测批内、批间精密度和日本积水医疗株式会社D－D检测试剂比较差异无统计学意义（P＞0.05），但关于该国产试剂的线性范围、功能灵敏度、临界值等其他检测效能指标，尚有待进一步验证［6］。

值得注意的是，本次试验纳入的162例健康者中，60岁以上人群所占比例不到10%，且未纳入妊娠期女性。但有研究显示，随着受试者年龄增长，D－D水平有所升高，而妊娠期、月经期女性体内组织纤溶酶原激活物（t－PA）大量释放进入血循环，使纤溶酶活性增高，D－D水平也增高［7］。此外，尿激酶、链激酶、肝素、避孕药、雌激素、某些抗高血压药物也可导致t－PA活性升高，引起D－D水平的变化［8］。因此，对存在上述特殊情况的人群而言，其D－D检测结果应给予更为全面的分析，所适用的参考区间可能也需单独建立。尤其是将D－D检测结果用于疾病诊断和疗效评价时，更应建立具有明确临床意义的临界值，避免单纯应用参考区间进行决策［9］。

本研究结果显示，该国产试剂与采用相同方法的日本积水医疗株式会社D－D试剂检测效能相当［10］。本研究采用了等效性检验的方法，与临床等效临界值比较，能够更为全面地验证其临床性能［11］。在实际应用中，有研究者将等效性检验等同于差异性检验不拒绝零假设的情形，若差异性检验为P＞α，则等效性检验结论为“等效”的比例随着标本量的增加而增加，当标本量大于150时，若差异性检验为P＞α，则等效性检验结论为“等效”的比例可达100%［12］。本研究所纳入的标本量较大，因此等效性检验和差异性检验结论相符。笔者认为在临床试验研究中，应注意上述两种统计学方法的差异，并同时注意标本量的大小。

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